第九章蛋白质组学的研究方法和进展.pptVIP

2021/3/26 * 特 点 获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质 鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质 适用于大规模蛋白质相互作用研究 2021/3/26 * 基本原理:将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上,当与待测蛋白样品反应时,可捕获样品中的靶蛋白,再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。 （三）蛋白质芯片（protein chips,protein array）技术 2021/3/26 * 依据的杂交反应原理: 抗原-抗体反应 配体-受体反应 蛋白质-蛋白质相互作用 2021/3/26 * 第三节 蛋白质组学在疾病 研究中的应用 2021/3/26 * 2021/3/26 * 2．基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略 原理:对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽,可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。 2021/3/26 * 二、蛋白质组功能模式的研究方法 2021/3/26 * 揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系,并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系,以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。 主要研究目标 2021/3/26 * （一）蛋白质翻译后修饰的研究 翻译后修饰 糖基化 乙酰化 甲基化 羧基化 二硫键 2021/3/26 * 修饰肽的检测的高灵敏度方法 蛋白质翻译后修饰的定量分析 合适的修饰状态下处理和电离条件 测定工作量巨大 研究面临的困难: 2021/3/26 * （二）蛋白质相互作用研究技术 生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 2021/3/26 * 1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。 以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。 1．酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system） 2021/3/26 * 转录激活因子GAL4的特点 N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UASG)结合的结构域 C端含GAL1转录激活结构域 2021/3/26 * 功能上相互独立又互相依赖,只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性 2021/3/26 * 系 统 构 建 分别构建含GAL4 BD 和AD 的两个酵母融合蛋白表达载体; 建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析的酵母菌株 2021/3/26 * 2021/3/26 * 主要特点和优势 使蛋白质表现型和基因型相联系 筛选cDNA文库 真实反应体内蛋白质间相互作用情况 不需分离靶蛋白 敏感性高 2021/3/26 * 缺 点 1.假阳性结果 2.假阳性结果 3.限于核内表达的蛋白质的相互作用 2021/3/26 * 2．噬菌体表面显示技术 ( phage display ) 三个基本因素: 在噬菌体pⅢ和pⅧ衣壳蛋白N端插入外源待筛基因编码的蛋白,形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面;同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别 2021/3/26 * 利用固相支持物上的抗体或受体,采用亲和筛选法（panning）,从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。 2021/3/26 * 主 要 应 用 筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质 研究抗体或受体的结合位点 构建随机肽库、抗体库和蛋白文库 改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性 研究新型多肽药物、疫苗和抗体 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学过程和新型的基因治疗导向系统 2021/3/26 * 主要优点 在细菌外完成 高度的选择性 亲和纯化反应高效性 不需要了解筛选分子结构 2021/3/26 * 缺 点 限制肽段大小 外源蛋白质无法正确折叠或修饰 融合蛋白可能会影响到蛋白质本身活性 2021/3/26 * 3．基于质谱的蛋白质相互作用研究方法 靶蛋白制备 蛋白质复合体的纯化 蛋白质复合体的质谱鉴定 基本步骤: 2021/3/26 * （1）亲和层析耦联质谱技术 基本原理:将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上,含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱,先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质,然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结合蛋白。 2021/3/26 * 先决条件 得到足够多的