聚谷氨酸高产菌株筛选及发酵条件优化..docxVIP

聚谷氨酸高产葡抹能选及发哮条件优化 中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2005, 25（12）:62 ?65 胡荣章1叶海峰1金丽1吴昌琳2吴自荣1* （1华东师范大学生命科学学院上海 2000622华东师范大学物理系上海 200062） 摘要Y - 报道了以11株枯草芽孢杆菌菌株为培养菌株，用 3种谷氨酸钠含量不同的培养基进行筛选 获得1株丫 : 初始pH、接种量、通气量等发酵条件的优化实验， 结果表明最佳发酵条件为： 250ml三角烧 瓶装液40ml,接种体积分数 5%,麦芽糖50g/L ,酵母膏10g/L ,谷氨酸钠30g/L , NaCl 10g/L , KH2PO4 5g/L, MgSO4 7H2O 0.5g/L，初始pH6.0，发酵60h，此时丫 聚睿気皎产呈収 达到30.26g/L，比国外报道的20g/L的产量有显著提高。纯化后产物经红外光谱及核磁共 振检测，鉴定为丫热 关键词聚谷氨酸芽孢杆菌筛选发酵条件优化 收稿日期：2005 06 28修回日期：2005 10 08 * 通讯作者，电子信箱： zrwu@bio.ecnu.edu.cn 丫 影打気酸 L 丫 polyglutamic acid, PGA是由微生物合成的一种细胞外高分子量聚合物，由谷氨酸的 a —氨基和丫 鞍基 缩合而成。Shih等］1 ］首次发现炭疽芽孢杆菌的荚膜中含有 丫 PGA随后发现有些芽孢 杆菌属细菌能够通过发酵培养积累 丫 PGA PGA分子链上具有较高活性的羧基（-COOH,可与一些药物结合生成较稳定的复合物， 在体内可被溶酶体降解为内源性谷氨酸， 并释放出药物，是一种理想的药物载体］2,3 ］。此 外，它还具有水溶性、可生物降解、可食用、吸水性强、对人体和环境无毒害作用等特性， 因而被广泛应用于食品、化妆品、水处理、农业医药等方面［4］。但由于微生物发酵产量低， 生产成本过高，因此还没有实现大规模生产，故筛选高产菌种、降低生产成本是解决问题的 关键。本研究从筛选高产菌种、优化发酵条件、提高产量着手进行了初步探讨。 1材料和方法1.1材料 1.1.1菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus. sp ）共11株，由本实验室保存。 1.1.2培养基斜面培养基和种子培养基均为 LB培 筛选培养基：培养基 A、 培养基 养基 1.1.3主要试剂丫 PGA标准品为Sigma公司产品，酵母膏、蛋白胨、麦芽糖进口分装，谷 氨酸钠为国产分析纯。 1.2方法 1.2.1发酵方法菌种活化：取菌种一环，接入斜面培养基， 37C培养11h，用作活化菌种。 种子培养：将1ml冻存菌种接入种子培养基， 37C、210r/min，震荡培养11h。发酵培养： 按5%接种量将种子液接入发酵培养基（ 250ml瓶装液50ml） 37C、220r/min，震荡培养一 定时间，测y PGA产量。 1.2.2分析方法细胞生长测定：发酵液稀释25倍，721分光光度计测其660nm处光吸收A660。 PGA测定：发酵液用蒸馏水稀释 4倍，12000r/min、15min离心去菌体，上清液加入 3 倍体积冰无水乙醇，搅拌得沉淀，干燥得粗品［ 6］，称重（每项试验重复 3次）。丫 PGA 纯化：用蒸馏水溶解粗品，对蒸馏水反复透析，透析液冷冻干燥得纯品。 产物结构表征分析： 采用Nexus 670傅立叶红外光谱仪测定 丫 PGA标准品及自制的丫 PGA样品］7上采用 AVANCE 500MHZ核磁共振仪测定自制的 丫 PGA样品］8］。13C NMF以 D20为溶剂，1H NMR以 H20为溶剂。 2结果与讨论2.1 丫 PGA高产菌筛选 丫 PGA生产菌分为两类，一类是谷氨酸非依赖型，如： B. subtilis TAM 4，B. licheniformis A35等］1 ］。另一类是谷氨酸依赖型 ［9］,而谷氨酸依赖型又可分为两小类， 一类需大量谷氨酸才能合成 丫 PGA 女口： B. licheniformis ATCC9945A, B. subtilis F02 1等】1］;另一类只需少量谷氨酸就能合成 丫 PGA（谷氨酸起诱导作用如： B.subtilis IFO 3335） : 1］。因此分别选用谷氨酸钠含量不同的培养基（培养基 A,B,C ）来筛选高产菌。 筛选结果发现，实验用菌在培养基 C （无谷氨酸钠）中均不合成丫 PGA而在培养基B （谷 氨酸钠20g/L ）中，只有菌株1#、2 #、5#、11#能合成丫 PGA但产量不高；在培养 基A （谷氨酸钠70g/L ）中共7株菌能合成丫 PGA而1#菌在培养基 A和B中产量均为最 高。故选1#菌株作为发酵条件优化菌株。 2005, 25（12）胡荣章 等：丫女 中国生物工程杂志 Ch ina Bio