植物总dna的提取.docxVIP

实验 1 植物总 DNA 的提取 生物总 DNA 的提取是分子生物学实验的一个重要内容。 由于不同的生物材料细胞壁的 结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总 DNA 的关键步骤。同时细胞内的物质也根 据生物种类的不同而有差异， 因此不同生物采用的提取方法也不同， 一般要根据具体的情况 来设计实验方法。 本实验介绍采用 CTAB 法提取植物总 DNA 的技术。 [实验目的 ] 学习和掌握学习 CTAB 法提取植物总 DNA 的基本原理和实验技术。 学习和掌握紫外光 吸收法鉴定 DNA 的纯度和浓度。 [实验原理 ] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如 CTAB ），可使核蛋白体解析， 然后使蛋白和多糖杂质沉淀， DNA 进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用 CTAB 法，其主要作用是破膜。 CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核 蛋白。植物材料在 CTAB的处理下， 结合65C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA被 释放出来。 CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（ 0.7mM ）浓度下可溶，并稳定存 在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部 分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 （24:1） 抽提去除蛋白质、多糖、 色素等来纯化 DNA ，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸 收高峰在260nm。纯的DNA样品A 260/280 1.8纯的 RNA 样品 A260/280^ 2.0并且 1g/mDNA 溶液 A260=0.020。 [实验器材 ] 1 、高压灭菌锅 2、冰箱 3、 恒温水浴锅 4、 高速冷冻离心机 5、 紫外分光光度计 6、 剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、 磨口锥形瓶（ 50ml） 9、 滴管 10 、细玻棒 11、 小烧杯（ 50ml） 12、 离心管（ 50ml） 13、 植物材料 [实验试剂 ] 1、3?TAB buffer （pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% 3■巯基乙醇 2、TE 缓冲液（ pH8.0 ） 10mmol/L Tris HCl 1mmol/L EDTA 3、 氯仿 -异戊醇混合液（ 24：1 ， V/V ） 4、 95％乙醇 5、 液氮 [实验步骤 ] 1 、称取 2g 新鲜的植物叶片， 用蒸馏水冲洗叶面， 滤纸吸干水分。 2、 将叶片剪成 1cm 长， 置预冷的研钵中， 倒入液氮， 尽快研磨成粉末。 3、 待液氮蒸发完后，加入 15mL预热（60 C ）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形 瓶中，置于65C水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。 4、 加等体积的氯仿 /异戊醇， 盖上瓶塞， 温和摇动， 使成乳状液。 5、 将锥形瓶中的液体倒入 50ml离心管中，在4C下8000rpm离心10min。 6、 离心管中出现 3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间 层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。 （根据需要， 上清液可用氯仿 /异戊醇反复 提取多次。 ） 7、 收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入 2 倍体积预冷的 95％乙醇。 边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为 DNA ）迅速缠绕在 玻棒上。 8、 小心取下这些纤维状沉淀， 加1?2 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟， 除去乙醇, 即为 DNA 粗制品。 9、 将粗制品溶于 TE 缓冲液。 10、 在分光光度计上测定该溶液在 260nm/280nm 紫外光波长下的光密度值。 [注意事项 ] 1 、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。 2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。 [思考题 ] 1、 CTAB 、 EDTA 、巯基乙醇的作用分别是什么？ 2、 液氮研磨的原理是什么？ 实验 2 质粒 DNA 的提取和酶切 质粒 DNA 是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。 质粒是细菌独立于染色体外的遗 传物质，是环状的双链 DNA 分子。由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被 改造为克隆和表达的载体分子。 限制性内切酶（Restriction enzyme , RE）是在细菌内发现的细菌降解外来 DNA的保护 机制。由于限制性内切酶通过识别特定的核酸双链序列并在特定的位点切断磷酸二酯键。 不 同的限制性内切酶识别的序列不同。 [实验目的 ] 通过本实验掌握碱裂解法提取质粒和限制性内切酶酶切的基本原理，掌握碱裂解小量 提取质粒的实验技术。 [实验原理 ] 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 D