广靶代谢方案模板-20181123.docx

代谢组研究方案 XX代谢组方案 背景简介 根据老师对代谢物的关注情况，推测老师可能是研究脱落酸与XX黄化过程的关系，基于此设计实验方案如下。 实验设计 设计1 正常生长状态下的XX，生长一定天数后，会出现黄化。X日龄后，取黄化和未黄化的部位组织分别命名为Untreat-yellow，Untreat-green。另一组XX使用适宜浓度的脱落酸处理，X日龄后，取黄化和未黄化的部位组织分别命名为Treat-yellow，Treat-green。每组样品需要3个生物学重复。 通过横向和纵向比较，筛选黄化与未黄化部位的差异代谢物、ABA处理对各个部位代谢物的影响；并对差异代谢物进行注释富集分析，拟找到与黄化、ABA相关的重要代谢物。 未黄化部位 黄化部位 ABA处理 Treat-green Treat-yellow ABA不处理 Untreat-green Untreat-yellow 设计2 正常生长状态下的XX，生长一定天数后，会出现黄化。根据前期表型，确定初黄化时间点（A），大面积黄化时间点（B），全部黄化时间点（C），分别取未发生黄化的组织和A,B,C三个时间点的组织，每组样品3个生物学重复。 通过两两分析，找到在发育过程中重要的差异代谢物质；整合4个时间点的代谢物数据，追踪内源ABA及其相关代谢物的含量变化，绘制动态变化曲线图。 设计3 正常生长状态下的XX，生长一定天数后，会出现黄化。以黄化的部位为中心，依次取黄化中心（1），黄化中心附近（2），黄化边缘（3），未黄化区域的组织（4），每组样品3个生物学重复。 两两比较，找到在发育过程中重要的差异代谢物质；整合4个部位的代谢物数据，追踪内源ABA及其相关代谢物的含量变化，绘制动态变化曲线图。 以上3种方案设计仅供参考，老师可以根据自己研究方向对方案进行整合或调整。如果代谢组样品和转录组样品一致，建议做代谢组和转录组的联合分析，能够做差异基因和差异代谢物的的关联，找到核心调控网络，深入阐释ABA与黄化的关系。 样本采集 预实验确定合适的ABA浓度，处理时间，选择适当的点取样，不同的个体尽量发育状态一致，采用3-5株取样混合为 1 次重复，每处理重复 3 次。。取样后，液氮速冻，-80℃冰箱保存，干冰寄样。 研究方式 表型统计 统计各组样品随着黄化程度加深的表型变化，比如开始黄化的时间，完全黄化的时间，黄化区域的比例等。 生化指标 用间接酶联免疫吸附法测定各组样品内源ABA的含量，绘制含量变化曲线。 代谢组 技术平台：LC-MS 代谢组分析内容 1.1 代谢物定性定量分析 质谱分析后的下机 wiff 格式原始数据，可通过软件 Analyst 1.6.2 打开浏览，并用于定性定量分析。图 1 所示为混样 QC 样本的总离子流图（Total ionscurrent，TIC，即每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱）及MRM代谢物检测多峰图（多物质的提取的离子流谱图， XIC），横坐标为代谢物检测的保留时间（Retention time， Rt），纵坐标为离子检测的离子流强度（强度，cps）。 图 1. 混样样品质谱分析总离子流图（上） 及 MRM 代谢物检测多峰图（下） 基于本地代谢数据库，对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。图1中MRM 代谢物检测多峰图展示了样本中能够检测到的物质，每个不同颜色的质谱峰代表检测到的一个代谢物。 为了比较每个代谢物在不同样本中的物质含量差异，根据代谢物保留时间与峰型的信息，我们对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。图 2展示了代谢物mr1267在不同样本中的定量分析积分校正结果，横坐标为代谢物检测的保留时间，纵坐标为某代谢物离子检测的离子流强度（cps）。 图 2. 样品代谢物定量分析积分校正 2.2 样本质控分析 通过对不同 QC 样本质谱检测分析的 TIC 图进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取检测的重复性。如图 3显示了第一与最后一个 QC 样本质谱检测 TIC图重叠结果，可以发现质谱检测较为稳定，重复性较好。 图 3. QC 样本质谱检测 TIC 重叠图 图 4. 样本及 QC 样本 PCA 得分图。三角形、方框分别表示品种 1（P1）与品种 2（P2）；黑色圆点表示质控样本（QC）； 不同颜色分别表示七个时期组织样本； X 轴表示 PC1，Y 轴表示 PC2。 对 QC 样本及组织样本进行代谢主成分分析， PCA 得分图（Score plot）如图 4所示，X 轴表示第一个主成分，Y 轴表示第二个主成分，QC 样本（黑色圆点）聚集在一起，其它样本且能够显著区别，结果表明样品质谱检测分析较为稳定，采集的数据质量较好