IVD+SOP_甲酸萃取法制备样本.pdfVIP

MALDI Biotyper 标准操作流程 (SOP) 甲酸萃取法制备样本 直接转移法鉴定失败后，可以采用甲酸萃取法。 1. 使用与直接转移法相同的样本进行以下所述鉴定步骤。 2. 确认要分析的样本具有符合实验室组织和物流体系的明确标识码。 3. 为了更好地进行样本跟踪，必须确保具有明确标识的样本及其在MALDI 靶 板上相应的样本位置经过确认和记录。 4. 取待测微生物样本 （来自单个菌落，取一个接种环的量即足以) 转移到盛有 300L 超纯水的Eppendorf 管中。 5. 用移液枪反复吹打，然后涡旋至少一分钟，在Eppendorf 管中形成均匀的混 悬液。 注：如果未能得到均匀的混悬液，则使用推荐的Eppendorf 微杵(# 0030 120.973) 。 6. 添加900L 无水乙醇，将悬液涡旋至少一分钟。 注：乙醇细胞悬液可直接用于蛋白萃取或在–18°C 的冰箱中保存最多6 个月。此外，乙 醇悬液可用于在环境温度下装运灭活的微生物(可稳定数日)。 注：乙醇可灭活大量的微生物。但是不包括产孢子生物体。 7. 离心菌体细胞 (离心机：2 分钟、13000 rpm) 并除去上清液。 8. 将第7 步重复一次，以完全除去乙醇溶液。通过移液枪除去残余乙醇。 注：鉴定可能会延迟、丢失或者无鉴定结果彻底除去乙醇非常重要。残余的乙醇会影响最 终谱图质量。 注：对于“关键性”微生物(例如，低细胞浓度)，必须在室温下对沉淀颗粒另外干燥几分钟。 9. 将30L HPLC 级超纯水和70uL 100% 甲酸转移到Eppendorf 管中。通过 涡旋震荡彻底混合。所得的混合液为70% 的甲酸水溶液。 10. 将50L 70% 的甲酸水溶液加入沉淀颗粒中，通过移液枪反复吹打然后进 行涡旋实现彻底混合。 注：如果只使用少量材料(一个单一菌落)，则可减少甲酸的体积 (最少可至1 μL)。 11. 加入50L 乙腈，通过移液枪反复吹打混合悬液。 注：如果只使用少量材料(一个单一菌落)，则必须按照针对甲酸所述的相同方式减少乙腈的 体积(参见第10 步)。 MALDI Biotyper 12. 离心微生物萃取物 (离心机：2 分钟，13000rpm)。 13. 将1L 微生物萃取物上清液移取到清洗后的MALDI 靶板上。 14. 确认每个样本的MALDI 靶位与所用的样本跟踪方案相对应。 15. 让样本在室温下晾干。检查制备样的外观是否正确。应观察到均质制备样。 注：样本晾干后，必须在1 小时内添加基质。 16. 将1L IVD HCCA 基质溶液 (如第3.6.3 节所述制备) 仔细涂敷在每个样 本上。 17. 让涂敷了基质的样本在室温下晾干。应观察到均质制备样。 18. 再次检查样本放置正确，以及基质液滴未溢出到另一位置中。 19. 样本已准备好并适合于运行整个鉴定过程。将MALDI 靶板立即插入 MALDI-TOF 质谱仪。 注：在制备后放置在MALDI 靶板上的样本必须在24 小时之内测试。 ©版权所有 布鲁克·道尔顿公司 2014 年