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RT-PCR常见问题及回答(引物｜RT-PCR) 　一、RT-PCR 　1. cDNA产量的很低 　可能的原因： 　*RNA模板质量低 　*对mRNA浓度估计过高 　*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足 　*同位素磷32过期 　*反应体积过大，不应超过50μl 　2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅 　*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系 　*与反应起始时RNA的总量及纯度有关 　*建议在试验中加入对照RNA 　*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10 　*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。 　*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决： 　a. 将第一链的反应温度提高至50℃。 　b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。 　3. 产生非特异性条带 　*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。 　*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。 　*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。 　4. 产生弥散（smear）条带 　*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高 　*减少引物的用量 　*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数 　*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。 　5. 产生大分子量的弥散条带 　*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的 　*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200） 　6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果 　*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。 　*有可能是引物二聚体的条带 　7. 扩增产物滞留在加样孔中 　*有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。 　*另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。 　8. SSⅢ与SSⅡ有何不同？ 　*具有更高的热稳定性（达50℃） 　*具有更长的半衰期（达220分钟） 　*对PCR无抑制 　*干冰运输 　*Tdt活性更低 　SuperScriptⅢ反转录酶 　9. 为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript？ 　ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSⅢ则更稳定。 　10. 为什么使用基因特异性引物（GSP）？ 　GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。 　11. 什么情况下需要使用RNase H？ 　在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时 　12. 根据不同的目的选择不同的系统： 　目的 建议 　RT与PCR使用不同的引物 　或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统 　高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统 　高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统 　或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统 　高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统 　长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果 　含Elongase酶的一步法RT-PCR系统 　二、Generacer 　1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？ 　使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求： 　*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm） 　*23-28个碱基长度，以提高引物特异性 　*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低 　2. 为什么得不到RACE产物？ 　*加入Hela对照 　*低质量的RNA模板 　*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成 　*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢