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淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（ Ficoll ）作密度 梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加 以分离。 实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备 ：1ml 移液器、移液管、 5ml 注射器、刻度吸管、 EP管、离心机、显 微镜 操作流程： 1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 无菌采集静脉血若干毫升 , 注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每 1ml 全血加 0.1ml 125-250U/ml 肝素溶液 ), 加盖后立即轻轻摇匀 , 使血液抗凝 3. 稀释（外周血：稀释液 =1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混 匀） 4. 用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清 楚的界面 （Ficoll ：稀释血 =1：2 ） 5. 放入离心机 1500r/min 离心 20min （注: 缓慢加速 1-4 档个 3 分钟 ） 6. 用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入 5 倍以上 体积的稀释液（生理盐水）， 1500rpm×10 分钟离心，洗涤细胞。 7. 重复洗涤一次， 1500rpm×10 分钟离心。 8. 末次离心后，弃上清，加入含有 10％小牛血清的 RPMI1640，重悬细胞 9. 计数细胞后再调整细胞置所需浓度 . 10. 取一滴细胞悬液与一滴 0.2 ％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个 大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度 ( 细胞数／ 1 毫升细胞悬液 ) ＝ 4 个大方格内细胞总数 ４ ────────── × 10 ×2( 稀释倍数 ) 4 11. 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项 : 6 1. 每毫升外周血液大约可获 1×10 单个核细胞 2. Ficoll 应适量，外周血应充分稀释 3. 温度直接影响到 Ficoll 的比重和分离效果 4. 在 Ficoll 上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污 染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1. 准备计数板： 2. 制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液 3. 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的 一侧加微量细胞悬液， 4. 计数：在显微镜下，用 10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数 5. 计算：将结果代入下式，得出细胞密度 胞数/ 毫升原 4 = （4 大格细胞数之和 /4 ）×10 注意事项： 1. 取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2. 加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡 3. 细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4 4. 本法要求细胞密度不低于 10 细胞 /ml 5. 镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、 计数