通过靶向调控通路抑制胃癌发生发展.docxVIP

CoNTENTSAbstract CoNTENTS Abstract in Chinese ．1 Abstract in English ．．4 Abbreviations ．8 lmroduction ．10 ⅣIaterials ．．13 】V【emds 20 I之esults 。32 Discussion 47 Conclusion ． ．50 R-ef．erences ．．5l AcknowIedgement 一56 Publications 57 Dissertation ．58 万方数据 山东大学硕士学位论文MiR_320a通过靶向调控FoxMl．P27ⅪP1通路抑制胃癌发生发展 山东大学硕士学位论文 MiR_320a通过靶向调控FoxMl．P27ⅪP1通路抑制胃癌发生发展 硕士研究生：王阳阳 导 师：王立祥副教授 专 业：药理学 中文摘要 研究背景： 胃癌是源于胃上皮细胞的严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，在我国，胃癌 有着高发病率和致死率。因此，揭示胃癌发生机制，发现关键的肿瘤标志物，进 而针对特异性的肿瘤标志物进行干预和调控，是防治胃癌的重要策略。 特异性microRNA(miRNA)表达异常可能是导致胃癌的重要机制之一， miRNAs通常在转录后水平调控基因表达，广泛参与细胞增殖、凋亡、发育分化 等过程，并与包括肿瘤在内的多种人类重大疾病的发生密切相关。因此miRNAs 已成为肿瘤研究领域的热点之一，验证肿瘤中异常表达的miI埘As所调控的靶基 因，明确miRNAs在肿瘤发生中的作用机制，进而评估特定miIⅢAs在肿瘤治 疗中的应用价值意义重大。 研究目的： 本文利用miRNAs微阵列芯片筛选出在胃癌中显著低表达的miR一320a，又 通过全基因组芯片和在线数据库预测出其下游靶标Forl(11ead box M1(FoxMl)及 FoxMl的下游分子P27K1¨，研究miR-320a通过靶向调控FoxMl．P27KIPl通路抑制 胃癌发生发展的作用，并探讨其相关机制。 实验方法： 1人胃癌组织样本研究 从山东大学齐鲁医院获得胃癌病人的肖癌组织和正常癌旁组织22对，利用 免疫组化和实时定量PCR检测miR一320a和FoxMl的表达，并通过对比确定两 者的相关性。 2体外实验研究 万方数据 山东大学硕士学位论文 山东大学硕士学位论文 2．1利用miR一320a的mimics和inhibitor分别转染胃癌细胞系AGS、BGc．823、 HGC，检测转染前后miR．320a的变化对FoxMl、P27K191的蛋白及mRNA表达 的影响； 2．2转染miR一320a的mimics和inhibitor后，检测胃癌细胞系AGS、BGC一823、 HGC的克隆形成数的变化； 2．3在FoxMl的3’uTR包含miR-320a的靶向结合序列，构建FoxMl的3’ uTR质粒和3’UTR突变质粒，通过双荧光素酶实验检测转染miR一320amimics 和3’uTR质粒／突变质粒的胃癌细胞荧光素酶活性变化； 2．4通过回复实验检测转染miR一320a inhibitor和FoxMl的小干扰IⅢA后， FoxMl和P27K1P1的蛋白及mRNA表达变化以及克隆形成数的变化。 3体内实验研究 选取8一】O周龄裸鼠，皮下注射miR-320a稳定干扰的BGC．823，稳定生长一 周后，每5天测量一次肿瘤体积并实时监测肿瘤生长情况，27天后处死并取瘤 组织，利用免疫组化和实时定量PcR检测FoxMl和P27K1P1的表达变化。 实验结果： 1 MiR．320a在人胃癌组织中表达降低，与FoxMl的表达呈负相关关系。 1．1提取胃癌与癌旁组织RNA进行qIUPCR，检测发现与癌旁组织相比， miR．320a在胃癌组织中低表达(’P0．05)，FoxMl mI矾A在胃癌组织中高表达 (+P0．05)。 1．2对胃癌中miR-320与FoxMl mRNA的表达做回归分析，发现miR．320a 与FoxMl的表达呈负相关关系。 1．3对临床病历资料进行分析，发现miR．320a与FoxMl mRNA的表达与病 人年龄、性别、肿瘤分化状态无关。 1．4对胃癌与癌旁组织切片做免疫组化，发现在胃癌中随着FoxMl蛋白表达 升高(“P0．01)，P27K191蛋白表达下降(”尸0。01)。 2 MiR．320a负调控FoxMl的表达，正调控P27ⅪP1的表达，且miR．320a 可以直接结合到FoxMl的3，UTR区。 2．1在胃痛细胞系AGS、BGC．823、HGc中，转染miR．320a mimics可在 mRNA和蛋白水平降低FoxMl的表达(+PO．05)，恢复P27K1P1的表达(’P0．05)； 万方数据 山东大学硕士学位论文