载体介导在胰腺癌细胞中转染效果的探讨.docxVIP

浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 序言 mPEG．SeSe—PEI载体介导在胰腺癌细胞 PANC．1中siRNA转染效果的探讨 浙江大学医学院 外科学(普外) 硕士研究生 张越峰 导 师 吴育连 序 言 RNA干扰(RNAi)是一种利用双链小于扰mqa(siRNA)诱导特定的mRNA沉默 的分子生物学技术11，同时RNAi提供了一种通过沉默致病基因而治疗疾病的新途 径孙。裸siRNA在体内容易被环境中的核酸酶(RNase)降解，半衰期短，而且转染 效率极低；因此，siRNA需要借助有效的运送载体才能进入细胞发挥干扰作用舢。 RIgA干扰介导基因治疗过程可以概括为以下几个步骤(如图1 38’)： 1．siRNA的包封：即组装体的构建。绝大多数siRNA载体与siRNA通过静电作用相 结合并包裹压缩siRNA分子。其中以载体通过自身的正电荷和siRNA所带的负电 荷作用而形成组装体这种方式最为普遍s叭。组装体粒子的粒径和形状与载体的分 子量、分子结构、环境的pH值以及载体与siRNA的电荷比(常用N／P比值表示) 有关。组装体的直径一般在几十到几百纳米之间，形状一般为球性。 2．组装体须在血清中保持稳定：载体包封si．RNA所形成的组装体常常需要进入血 液循环以便发挥治疗作用。血液中含有大量的电解质以及带负电荷的蛋白质，这 些电解质和蛋白质也会与组装体之间相互作用，可能使组装体解离而释放出siRNA 或者使组装体纳米粒子相互聚集沉淀，甚至造成血栓·n。此外，组装体纳米粒子 还要克服肾脏的滤过作用和体内巨噬系统的吞噬清除作用40、。只有在体内停留更 长的时间，才能发挥更有效的作用。 3．组装体对目标细胞特异性的作用：即所谓的靶向运载。载体携带siRNA特异性地 II 万方数据 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 序言 富集到目标组织处，不仅可以提高叭i的效率，同时还可以避免非特异的RNAi 带来的副作用42、。靶向性一般可分为两种：主动靶向性和被动靶向性43、。在本论文 的综述章节有详细介绍。 4．细胞摄取组装体：当组装体到达靶向组织细胞处时，先与细胞膜相互作用，然后 进入细胞。组装体进入细胞的机制尚不完全清楚，目前公认：胞吞(包括吞噬和胞 饮)，脂质介导的跨膜运载等44-47)。组装体的种类，粒径大小，电荷性质，表面修 饰物以及细胞膜的成分都会影响组装体进入细胞的途径。 5．组装体从内涵体中逃逸：通过内吞途径进入细胞内的组装体会滞留在内涵体中。 内涵体膜上存在ATPase质子泵酶，能够不断将内涵体外的H+泵入内涵体中，因 此内涵体内的pH值约在5-6之间。同时内涵体中富含核酸酶。不能快速有效地逃 逸出来的sLRNA会在内涵体中被降解48)。因此siRNA组装体从内涵体中快速逃逸 也是成功基因治疗的重要一环。 6．组装体的解离及迁移：组装体解离并释放siRNA是递送过程中的最后一个步骤。 一般认为细胞内聚阴离子对siRNA分子的替换作用是载体与siRNA解离的主要驱 动力49-so)。 7．在细胞质中，siRNA发挥RNAi效应。 11I 万方数据 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 序言 图1载体运载siRNA的过程示意图 缺乏理想的siRNA载体系统一直是RNAi技术应用于临床的障碍之一。siRNA 载体总体上可以分为两大类：病毒载体和非病毒载体。非病毒载体因为安全性和可 控性更高，目前受到极大的关注，相关的研究也更多。非病毒载体已被广泛地研 究，聚乙烯亚胺(PEI)载体具有较高的转染效率，被认为是非病毒载体的“金标准” 15-17)。然而，由于其明显的细胞毒性，限制了它的进一步应用18)。其中一个来克服 这一缺点的策略是通过聚乙二醇(PEG)修饰PEI，虽然这种修饰能降低细胞毒性 19_22)。但是，聚乙二醇的加入能导致PEG-PEI／pDNA的细胞内化效率降低，还会影 响pDNA从内涵体中逃逸20,23，24)。王幽香教授课题组开发了一种新型PEI为基础的 GSH浓度响应的聚合物载体：mPEG．SeSe．PEl2们。它的主要特点是用双硒键链接 PEG和PEI。双硒键在细胞内GSH浓度相对较高的环境中容易断裂，使得组装体 的稳定性下降，有助于pDNA组装体从内涵体中逃逸。研究表明：mPEG．SeSe—PEI 在HepG2细胞中转染质粒时，比PEI，PEG—PEI和PEG—SS．PEI有更高的转染效率， 同时其毒性