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甘蔗14—3—3基因真核表达载体构建及分析 14-3-3蛋白是一种酸性二聚体可溶性蛋白，是高度保守并在真核生物中普遍存在的一类调节性蛋白，可通过识别特异的磷酸化序列与靶蛋白相互作用。近几年来，有关植物14-3-3蛋白的研究己取得较大进展（如：参与多种植物激素信号转导、各种代谢调控、物质运输和光信号应答等调控过程），使之成为生物化学及信号途径研究领域中的前沿课题[1-2]。然而，14-3-3蛋白与一些蛋白之间的相互作用机制仍不清楚。与模式植物相比，14-3-3蛋白在甘蔗等一些经济作物上的研究仍然很少，尤其是通过改变14-3-3蛋白活性进而来调节和影响植物发育代谢相关的信号通路，以提高作物的品质和产量，尚有待进一步研究探讨。 本课题组前期克隆得到一个编码甘蔗14-3-3的基因，发现其与玉米和高粱蛋白的同源性较高，并通过相关软件和网站对14-3-3蛋白结构特征进行预测和解析，发现一些功能活性位点（已被《南方农业学报》收稿）。有研究表明14-3-3蛋白调节功能的行使依赖于靶蛋白磷酸化来发挥作用，不仅调控许多关键信号蛋白（如BZR1、RSG和CDPK1等）的信号转导，而且可以作用于同一信号通路上不同的信号蛋白。再者，14-3-3蛋白虽然高度保守，但其N-端和C-端均具有较高的变异性，这一特征可能与14-3-3蛋白功能的差异性相关。 为明确甘蔗14-3-3蛋白激酶结构域和N-端及C-端的功能，本研究通过构建真核表达载体，用双酶切和测序技术加以验证，最后使用Western Blot检测蛋白的表达量和纯度，为了解蛋白功能活性位点及下游信号转导研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料与试剂 甘蔗（S.officinaram L.）茎段采自中国热带科学院南亚热带作物究所甘蔗种质资源圃，材料立刻放于液氮中处理，并置于–80℃保存备用。 一链合成试剂盒、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒购自天泽生物公司；胶回收和质粒提取试剂盒购自美国OMEGA生物技术有限公司；pGEM-T Easy Vector购自Promega公司；其它生化试剂为国产分析纯。 1.2 甘蔗总RNA提取和14-3-3基因扩增 甘蔗总RNA提取使用天泽生物公司RNA提取试剂盒，具体操作根据说明书进行。DNAstar、Primer 5.0和DNAman等软件用于序列分析和引物设计。mRNA Selective PCR Kit Ver 1.1一步法（TaKaRa）对目的基因进行RT-PCR，反应体系为：2×mRNA 选择性PCR缓冲液Ⅰ25μL、MgCl2 10μL、dNTP混合剂5μL、RNase抑制剂1μL、逆转录酶1μL、正反向引物各1μL（正向引物：********************GTT含有EcoRI的酶切位点；反向引物：********************CTCG含有NotI的酶切位点）、约1μg总RNA、混合模板1μL、最后加入无RNase H2O至总体积50μL，扩增程序为50℃ 15min；85℃ 1min，63℃ 1min，72℃ 2min，共38个循环，72℃ 10min，-20℃保存备用。反应结束后，取上述扩增产物于含EB的1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统下观察电泳结果。回收PCR产物与pGEM-T Vector（Promega公司）连接，转入DH5α中，验证阳性克隆后呈送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 1.3 PCR产物的回收、连接和转化 PCR产物回收依据OMEGA琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒说明进行，后与pGEM-T载体在4℃条件下连接过夜。将上述连接产物转入DH5α感受态细胞，通过蓝白斑和酶切双重手段对阳性克隆进行筛选。 1.4 pPIC9K-14-3-3表达载体构建 结合引物设计的酶切位点，用EcoR I和Not I对PCR产物进行双酶切，将目的片段经琼脂糖凝胶电泳分离后与pPIC9K表达载体相连（图1），10μL反应体系为：T4 DNA连接酶1μL，反应Buffer 1μL，载体2μL及6μL目的片段，4℃反应过夜，混合反应液转入DH5α感受态细胞。提取重组质粒，用EcoR I和Not I双酶切进行阳性克隆鉴定。 e：＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼农学通报2013-21＼4871-1.tif/e：＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼农学通报2013-21＼4871-1.tif 图1 pPIC9K-14-3-3表达载体构建路线 1.5 毕赤酵母转化 酵母转化依据酵母表达系统手册进行（Invitrogen，California，USA）。10μg含有目的片段的表