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显微摄影技术 显微摄影是一项重要的显微技术，同再现显微镜中物体影象的各种方法比较， 显微摄影是最好的方法。它对以显微镜作为研究工具的研究人员是必备的手段， 尤其在研究染色体及其分子特征时，就更加显得必要了。现在数码相机的问世， 又使显微摄影变得更为简便，且效果好。在有关学术研究和理论探讨时，一帧好 的显微照片，可以省去许多的文字描述，并且使人心悦诚服。何况在生物学领域 中，确有不少问题的研究，必须借助显微摄影。 下面，仅以植物染色体作为拍摄材料，概述显微摄影的基本方法，数码显微 摄影的操作流程和传统的显微摄影基本一样， 只是省去了底片和暗房技术，由计 算机完成。 、显微摄影对制片标本的要求 染色体只见于有丝分裂和减数分裂的细胞核中，根尖、茎端、幼嫩花药和胚 珠是镜检染色体的材料，尤以根尖和花药更为常用。观察染色体的形态、结构和 数量，常用酶解或压片法制片。此法能保持染色体的完整，并能接近于活体状态。 一张好的显微照片，来源于完好的染色体制片标本。 适于拍照的制片标本，应具 下列条件： 1、选用标准的载玻片和盖玻片 光源入射光束，经载玻片透射标本，再经盖 玻片进入物镜，处于光路之中的玻璃，应是表面无伤，内无气泡；外无霉斑。这 样可以杜绝光线乱反射，防止阻光、降低亮度以及有损清晰度。载玻片厚度不宜 超出聚光镜的焦距，一般在2毫米以内，可将光源的光束集中于载玻片的标本上。 盖玻片的标准厚度为0.17毫米，若使用厚度大于工作距离的盖玻片，物镜前透 镜会触及盖玻片，同时不能准焦；盖片厚，球差就大，会降低影象质量。有效盖 片厚度，包括封固剂的厚度，即树胶或尤派胶用量，因此，封固剂要调稀，少许 滴加一薄层。 2、 染色体处于相宜的时期，平展逸散，完整无损 染色体的计数和组型分析， 以有丝分裂的中期（或晚前期），减数分裂的终变期和粗线期为宜。这时染色体收 缩变短，呈典型状态，易识别。通过前处理的精细加工，染色体相互逸散，互不 接触，并尽可能使之平展于同一水平面上，又不失细胞的完整轮廊 （图3-1）。 3、 染色鲜明适度 染色体过染，染料堆积，使染色体模糊成一块，难以辨别 细节，缺乏质感；染色体着色过浅，使影象不鲜明，辨认不清，反差不大。染色 体染色以蓝紫为佳，色彩鲜明，胶片易感受，拍摄效果好。一般多用铁矶苏木精 染色制片。当然，醋酸洋红和孚尔根反应也可以。细胞质染色应浅淡，以辨清细 胞质的完整轮廓为准。常用铁矶苏木精过染，再用 45%醋酸软化和分色，结果 染色体着色蓝黑而鲜明，细胞质浅淡而不明显，增大了色彩的对比，扩大了影象 的明暗反差。 4、清洁无尘，消除气泡 制片中的灰尘异物和气泡，有损影象的质量，防碍 观察。气泡为临时制片的常见弊病，小的气泡有碍观瞻；大的气泡连片，推挤染 色体，堆积集中，损坏了好的影象。要随时滴加所用的临时封固液，消除气泡 二、选用优质物镜和接目镜 显微摄影是以接物镜和接目镜作为摄影镜头，其中接物镜尤为重要，物镜的 分辨率就是显微镜的分辨率。目镜与显微镜的分辨率无关，它只有把物镜已放大 的影象进一步放大，既使是最好的目镜，也无法观察到未被物镜分辨的细节。 所 以摄影时，物镜要严格选择，不可任意滥用。 1、物镜 接物镜种类繁多，光学性能相差悬殊。摄影时必须选用得当，绝非任 一物镜皆可产生最佳影象。 物镜由透镜组成。单片透镜具有多种象差，一个完善的物镜，是由一组复杂 的透镜组成。按象差矫正程度，物镜可分消色差物镜，复消色差物镜，萤石物镜 和平象物镜等类别。 消色差物镜，因制造容易，是最常见的物镜。金属外壳上不刻代表 （图3-4左）。 该物镜将光谱中红光和蓝光聚焦于一点，黄绿光则聚焦于另一点。其最佳清晰范 围是在510卩m毫微米）绿光区至630^m橙光区间（图3-2Ach红）。消色差物镜性 能较差，不适于显微摄影。因未经矫正的蓝光对感光胶片的乳剂膜非常敏感， 全 色胶片对未经矫正的红光也能感应。 如果必须使用时，加用黄绿色滤色片，也可 获得清晰的影象。 复消色差物镜的性能很高，能将可见光谱中的红、蓝和黄光聚焦于一点，改 正了红、蓝色光的球差和其他象差。最佳清晰范围从波长 400nm至720nm（图 3-2Apo线），容纳了全部可见光谱。适于任何色光下或加用各色滤色镜摄影，更 适于彩色摄影。但是，复消色差物镜残留有象场弯曲，使平面物体形成类似球形 弯曲的影象。结果使视野中心和边缘的影象不能同时准焦， 给摄影带来不便。拍 出的底片中心清晰边缘模糊或相反。象场弯曲可以通过选用特殊的目镜加以克服 矫正。复消色差物镜的金属外壳，刻有 “Apo字样，供作识别（图3-3）。 萤石物镜，色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间，故又可称半复消 色差物镜。最佳清晰范围在波长 430nm至680nm（图3-2 I线），包括了绝大部分 可见光谱。