修饰动物模型的建立及应用.pptxVIP

第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology一、分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 复性RNADNA核酸分子杂交的原理 带有某种标记的核酸单链作为探针，在一定条件下， 按碱基互补配对原则与互补的核酸单链退火形成双链杂交体， 鉴定靶序列的存在、分子大小或进行靶序列的相对定量分析。 核酸分子杂交的杂交动力学 核酸分子杂交 核心序列形成 自发过程 （一）印迹技术（二）探针技术 探针 (probe) 探针的来源 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 其他斑点印迹 (dot blotting)原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵 (DNA array)DNA芯片技术 (DNA chip) 核酸杂交技术（一）Southern Blot 原理用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 Southern Blot 操作步骤：DNA琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色斑点印迹杂交(Dot blot)斑点印迹 优点简单、迅速；核酸粗提、多样品检测 缺点不确定分子量、特异性不高，假阳性原位杂交 （In Situ hybridization） 标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交。 1969, Pardue --爪蟾核糖体基因探针 1970, Orth 兔乳头状瘤病毒cDNA探针 Western Blot 原理 操作过程SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应洗涤 显色或化学发光显影 Hours 0 4 8 16?Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3/Bcl-2. Cells were treated with 20?M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.?注意的问题蛋白质电泳常用SDS非变性PAGETris-Tricine胶中电泳聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套三种印迹技术的比较②③①分子杂交实验目 录放射自显影照片目 录DNA芯片 DNA芯片: （Bio-chip、DNA arrays、Oligonucleotide microchip) 特点：高度并行性，多样性，微型化和自动化。 GenomicExpression 1. Extract genomic DNA from tissue1. Extract mRNA from tissueTumorSample2. Produce cDNA by RT Label 2. Label3. Mix with labeled reference cDNA 3. Mix with labeled reference DNA 4. Hybridize to Chip4. Hybridize to Chip 5. Wash and Image5. Wash and ImageAssay FormatsNormalSample DNA micrarray robot enclosed in a temperature and humidity controlled environment. Research Use——From Sequence to function 计算Ratio 值 (= Cy3/Cy5) 在 0.5-2.0 之外的定义为在两样本中有明显差异表达。进而获取初步功能信息。 Clustering 芯片杂交结果示意图DNA点阵目 录DNA芯片技术的主要应用① 分析基因组、发现新基因② 基因表达的研究③ DNA序列分析④ 基因诊断⑤ 基因药物设计第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymer