核酸含量测定.pptxVIP

1 核酸定量测定常见的方法 1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。 2 定磷法的原理 首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为： (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 • MoO3（钼蓝） 3 还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA的含磷量平均为9.9%。 4 试剂 酵母RNA样品溶液：2000μg/mL 标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL 5 实验步骤 1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线； 3. 测定回收率和样品总磷量。 6 1. 样品消化（每两组或三组做一份） 消化管 1 2 3 RNA/mL 0 1 0 标准磷原液/mL 0 0 1 dH2O/mL 1 0 0 5mol/L H2SO4/mL 2 2 2 消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却 dH2O/mL 1 1 1 沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却 用dH2O定容/mL 50 50 50 混匀 7 2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作：     1  2 3 4  5  6 标准磷溶液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 dH2O/mL 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 定磷试剂/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0 8 3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行） 7（空白）  8（样品） 9（标准） 定容溶液/mL 1.5 1.5 0.15 dH2O/mL 0 0 1.35 定磷试剂/mL 1.5 1.5 1.5 用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0 9 数据处理 关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管作为空白。 以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。 10 计算回收率： (2) 计算样品总磷量： (3) 计算RNA量： (4) 样品RNA含量： 11 操作注意事项 1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。 12 思考题 1. 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。 13 实验结束 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面