核酸和蛋白质分析技术.pptxVIP

核酸和蛋白质分析技术;第一节 核酸分析技术;一、核 酸 电 泳 ;琼脂糖凝胶电泳的基本过程;不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围;影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： ;琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成; ;特殊的凝胶电泳; 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 ;二 核酸杂交技术; Southern Blot 操作步骤：;原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 ;操作过程;（三）探针标记技术;三 PCR技术; （一）原理： 双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA －－－变性 ↓ 与一对寡核苷酸引物（5’， 3’）降低温度退火 DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火 ↓ 适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA －－延伸 ↓ 第二轮：变性—退火—延伸 呈指数增长 理论值：一轮一倍 10轮 103=1000倍 20轮 106 30 轮 109 理论 模板扩增30轮 1ng-----------1g 实际 模板扩增30轮 1ng-----------10?g;1 Taq DNA聚合酶： 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 ①5’?3’DNA聚合酶活性； ②无3’?5’外切酶活性， 35轮0.25%错配，与原始模板有差别； 最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸 半衰期：92.5℃ 130min 95℃ 40min 97.5℃ 5—6min 变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性;pfu DNA 聚合酶; 2 .引物 人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条10-50pmol /100?l ◆设计原则： （1）靠近5上游Primer与双链DNA正链相同 3下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 正链5————— 3 ——上游Primer ——下游Primer 负链 3————— 5 例如： IL-3正链 5GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3 负链3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5 上游~： 与其相同 下游~： 先写出相应负链3→5然后倒过来5→3 所以负链Primer：5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3;（2）Primer 本身不要出现内部互补序列 形成loop环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意减少Primer间互补序列 导致2个Primer形成dimer 一般不要超过3个互补bp 如：CCCATGC ATGGAGTC