九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制.ppt

CD4绝对计数结果 内置微处理器实现数据自动分析 自动打印质控与病人的检测结果 简单易用的系统控制面板 配套的样本制备工作台 简捷的样本制备方法，避免细胞损失 BDB FACSCountTM 系统 仪器性能 样本稳定性 制备后室温(20—25 0C)储存48小时 全血稳定性 采集后室温(20—25 0C )储存48小时 仪器性能 范围 CD4+: 50-2000个细胞/ uL CD8+: 100-2000个细胞/ uL CD3+: 100-3500个细胞/ uL 检测试剂盒组成（50人份/盒） 荧光试剂 2个组合/人份 CD4PE/CD3PE-CY5 CD8PE/CD3PE-CY5 固定液 效期 2—8 0C储存6个月 质控试剂盒（50人份/盒） 零，低，中，高 4种靶值微球 效期 2—8 0C储存1个月 使用简单方便 安装简便，一体式设计，无需外源计算机 即开即用，无需调试校准 全自动软件自动识别分析淋巴细胞群体 自动错误报警 实验报告 CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 CD4/CD3 CD8/CD3 报告项目 自动设定分析区域 CD3 Size CD3 CD4 内参微球 设定分析群体 CD3 CD4 CD3 CD8 CD8 管分析 绝对计数公式 CD4 细胞数 内参微球数 X # 获取微球数 mL 全血体积 = CD4 细胞 mL 全血 举例 # 2 # 1 X # 获取微球数 mL 全血 = CD4 细胞 mL 全血 CD3 CD4 绝对计数计算 CD4 质控微球 绝对计数计算 CD4+T细胞检测的质量控制 质量控制 是指在每一次实验过程中为确保实验工作正常进行而必须采取的各种措施。 实验前质量控制 　　①采集标本前病人的准备； 　　②正确的标本采集方法； 　　③准确及时的运送标本； 　　④实验前正确地处理和保存标本。 实验中质量控制 　　①质控品的准备； 　　②试剂的评价选择 ③ 仪器的校准 　　 ④开展Levey-Jennings 质控图质控（或“即刻法”质控）。　 实验后质量控制 　　①实验后准确填写检验结果； 　　②及时发出报告； 　　③正确地解释检验结果的临床意义　 ④文件管理 实验前质量控制 特别注意 运输温度：室温 运输时间： 双平台6小时，单平台24小时 样品处理：专人，及时， 规范。 虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。其它的免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:- 丙球蛋白缺乏症- 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症)- 严重的联合免疫缺陷 提 示 CD4+ T细胞计数的方法 非FCM 技术 FCM 技术 -自动化方法 -可靠性高(变异系数低) 精密度、准确度和可重复性高 高通量 金标准技术 优点 -设备昂贵 -试剂昂贵 - 需要熟练技术人员操作 缺点 -简单 -低廉 优点 -低通量 -难于质控 缺点 仪器的选择 1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞仪（ FACSCalibur、Coulter) 2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪（ FACSCount、Guava) 3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads） 4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200 /ul。 非流式细胞技术 免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免疫荧光染色） 细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜） Dynabeads技术计数CD4细胞 原理 用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分离全血中CD4T淋巴细胞 方法 将125?l新鲜血液，放入EDTA管，加350?lPBS，再加入25?l mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS洗涤2次，加入50?l Lysing溶液，着色，用epifluorescent显微镜计数。 价格：3美元/人份 流式细胞术（flow cytometry, FCM） 流式细胞仪 BD FACSVantage BD-Calibur 对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选 ●FCM的特点 保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏 从分子水平获取多种信号 对细胞进行定量分析或纯化分选 功能特点 （1）多参数定量分析每一个细胞； 　　（2）细胞分选； 高纯度：