CHO细胞无血清培养基技术标准手册.docxVIP

精品文档 精品文档 PAGE PAGE10 精品文档 PAGE CHO细胞无血清培养基技术手册 1CHO 细胞 CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞 (ChineseHamsterOvary ，CHO)，1957 年美国科罗拉多大学 Dr.TheodoreT.Puck 从一成年雌性仓鼠卵巢分别获得， 为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上宽泛使用的细胞系。 工业生产上应用较多的是 CHO-K1 细胞，为转变细胞系，细胞染色体散布频次是 2n＝22，系亚二倍体细胞。 ATCC保留CHO-K1 细胞株，编号为 CCL-61，被 宽泛地用于重组 DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸 -γ-半醛，培养 过程中需在培养基中增添 L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞， 经多次传代筛选后，也可悬浮生长。 ATCC 提供的CHO-K1 细胞照片 CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是优异的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸复原 酶（dihydrofolatereductase ）营养缺陷型突变细胞株 （CHO/dhfr -）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutaminesynthetase,GS ） 基因的GS-CHO 细胞。 二氢叶酸复原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶 酸复原成四氢叶酸。关于 dhfr突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养 基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（ hypoxanthine ）和胸苷（thymidine ），则突变体细胞能够借助核苷酸的补救合 成途径维持生长。利用 dhfr 基因进行筛选时，首先将重组 DNA分子导入 dhfr-表型的受体细胞，然后撤除原培养基中的的次 黄嘌呤和胸苷，即可获得 dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。因此在精选表达外源基因的阳性克隆细胞时需采用不含次黄 嘌呤和胸苷的培养基。此外，氨甲喋呤（ MTX）选择压力可使 CHO/dhfr-细胞的外源基因的拷贝数扩增并得到较高水平的表 达。 CHO-GS细胞是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶 (GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞 CHO，再经过 L-氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulphoximine ，MSX)等化合物选择加压促进GS基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组 细胞株，可在不含谷氨酰胺培养基中生长、增殖，可防止或减少细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积累的氨对细胞的损害、抑制作 用。 ATCC提供的CHO/dhfr -细胞照片 2CHO 细胞表达系统的优势与特点 由于哺乳动物细胞构造、功能和基因表达调控的复杂性，外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较 大差别，因而外源基因在哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细胞中的表达所需的元件。外源基因在哺乳 动物细胞中的表达包括基因的转录、 mRNA翻译及翻译后蛋白质的加工等过程，如蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成以 及蛋白质分子内或分子间二硫键的形成等比较复杂，要表达具有生物学功能的蛋白质如膜蛋白、抗体和具有特异性催化功能的 酶需要在哺乳动物细胞中进行。 哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基根源则是根源丰富、转变效率高、表达效果好， CHO细胞作为表达系统除具有上述 的特点要求外，还有以下优势： ）外源基因被整合到宿主染色体上后，在没有选择压力的情况下能稳定保持； ）适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达，并且很少分泌自己的内源蛋白，便于下游产物分别纯化； ）对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养； ）细胞可进行贴壁培养也可进行悬浮培养，且具有较高的耐受剪切力和渗透压能力； 5）可进行高密度大量培养，进行较大规模生产时其培养量可放大到 20000L 以上，是目前应用最宽泛的哺乳动物基因表达受 体细胞之一。 还有研究者尝试将类胰岛素生长因子 IGF基因和转铁蛋白基因转入 CHO细胞获得能自己分泌必需蛋白的 “超级CHO”，无 需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在无血清培养基（ SFM）中生长优异。 3CHO 细胞在生物制药中的应用 目前已有多种外源基因如人组织性纤溶酶原激活剂（ tPA）、人促红细胞生成素（ EPO）、乙肝表面抗原（ HBsAg）、干 扰素γ（IFNγ）、扰乱素 β（IFNβ）、白细胞介素 2（IL2）、凝血因子Ⅷ等在 CHO细胞中得到表达。在美国已注册的大概 73种蛋白药物生产中，应用哺乳动物细胞培养的有 35种，CHO细胞培养的就占 27种，其中包括 10种单克隆抗体。下表是 以CHO细胞培养为基质生产的重组制品。