酶动力学分析实验课件.pptVIP

注意事项 1 底物和酶取样准确 2 保温时间准确 1 2 3 4 5 6 7 加入酶的时间 加入碱性溶液 终止反应的 时间 9:00:00 9:00:30 9:01:30 9:02:00 9:02:30 9:03:00 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00 9:16:30 9:17:00 9:17:30 9:18:00 加入酶液立即计时，保证每个试管的反应时间为15分钟 显色反应 保温结束，立即加入1ml碱性溶液终止反应 加入1ml 4-氨基安替比林+2ml 铁氰化钾，充分混匀，放置10min. 8管调零，510nm处比色。 二、抑制剂对AKP酶活性的影响 试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 底物（ml) 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.8 碳酸缓冲液（ml) 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 蒸馏水（ml) 0.8 0.75 0.7 0.65 0.6 0.5 0.1 0.9 25mol/L KH2PO4(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 37℃水浴保温5min 酶液（ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 最终底物浓度（mmol/L) 2 3 4 5 6 8 16 0 Table2 加入酶液后，立即精确计时37℃水浴15min 实验报告 1 绘制矩形双曲线图 2 因各A值与其酚含量成正比，故用A代表 酶促反应速度，不做酚标准曲线，以1/[S] 对1/A作图 3 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸苯二钠的Km值 借用Km测定中的双倒数图，并与其在同一张坐标纸上画出1/[S]-1/A510曲线 比较两曲线，计算Km值，与未加抑制剂时的Km值比较，判断抑制剂类型，并计算Ki值。 1 做如下表格 2 电脑作图 3 实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终必须得出结论：Km值等于多少 1 2 3 4 5 6 7 ABS [S] 1/ABS 1/[S] * * 生物化学与分子生物学实验 碱性磷酸酶 动力学分析 分光光度法 定义： 根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法。 互补色 互补色光—— 如：黄光和蓝光； 红光和青光。 溶液的颜色实质是它所吸收的色光的互补色。如：日光照射KMnO4，其中绿光被吸收，故溶液呈紫色。CuSO4呈蓝色是由于溶液吸收了黄光。 溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。 比较溶液颜色的深浅，实质比较溶液对光的吸收程度。 溶液的颜色 基本原理 Lambert-Beer定律，吸光度与溶液的浓度成正比，与光束通过溶液的距离(即光程)成正比，用数学表达式表示为： A=KLC C：物质的浓度(mg/ml, mol/L)，L：光程（cm），K为吸光系数或消光系数。 当一束平行单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部分则透过溶液。 入射光强度为I0，透射光强度为It， 则透光度 T= 吸光度(A)或称光密度(OD)或称消光度(E) A= - lgT A=KLC I0 It ※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。 影响酶促反应的因素 酶促反应动力学：研究酶促反应速率及其影响因素，并进行定量分析。 影响因素包括： 底物浓度 酶浓度 pH 温度 抑制剂、激活剂等。 底物浓度对反应速率影响 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。 当底物浓度较低时： [S] V Vmax 一级反应：反应速率与底物浓度成正比。 随着底物浓度的增高： [S] V Vmax 混合级反应：反应速率不再成正比例加速。 当底物浓度高达一定程度： [S] V Vmax 零级反应：反应速率不再增加，达最大速率。 米-曼氏方程 [S]：底物浓度 V：酶促反应速率 Vmax：最大反应速率(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant) Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ——— ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。 Km值 当反应速率为最大反应速率一半时： Km = [S] Km = [S] 2 = Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 Km值 Ｋm值