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Chapter Four 基因工程的基础知识 与基本技术;第三节 DNA序列分析;;;1.Sanger双脱氧链终止法原理;;2 具体操作：; 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:;;3、技术路线：;4.双脱氧终止法测序反应体系：;Sanger法DNA测序的试剂;This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3 carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction. ;5.测序过程:
(1) 模板纯化与引物合成
(2) DNA链的延长和合成阻断
四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记引物
终止剂不同 ddA ddG ddC ddT
四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链
(3) 电泳 ACGT次序 高压电泳
(4) 放射自显影得到直读图象;;;1.化学裂解法测序的原理;在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：
G反应----硫酸二甲酯（DMS）使G的N7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶（也叫六氢吡啶）置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。
G+A反应----甲酸使嘌呤环上N原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。
T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。
C反应----在高NaCl存在时，只有C与肼（联氨）发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换;碱基特异性修饰及裂解;（1）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料
（2）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸
（3）多核苷酸酶催32P dNTP标记（5’-OH）末端
（4）使标记片段变性为单链
（5）分4个反应体系，按上述程序（4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂）， 这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长
（6）电泳
（7）放射自显影
（8）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出;;3.化学??的优点;;四标记单泳道法：
ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的产物，4个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分， 再用计算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序信息。
这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。
;荧光标记物;聚合反应及产物;;分析仪器的新发展：;;作业：
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