第一届实验室培训2DE安排.docxVIP

精选文档 精选文档 PAGE PAGE11 精选文档 PAGE 第一届全国先进电泳及其质谱联用新技术培训商议会实验流程2DE 一、培训内容：双向凝胶电泳技术培训，包含 1、新式等电聚焦电 泳仪器，2、高分辨IEF新技术，3、高分辨2DE新技术 二、培训时间：8:30-11:50AM（3h20min），1:30-5:20PM（3h50min）三、地点：生物医药楼4－326 四、每次培训预约人数：18人 五、培训准备时间安排： 注：同一组颜色为一组培训内容，灰色为准备工作。测试样品 为IEFmarker。IEF仪器为伯楷安IEF仪。IPG为伯楷安IPG， pH3-10,7cm。PAGE预制胶为伯楷安 PAGE预制胶，well 孔，12%。 21号8：30，水化胶条12根。 21号20：30，水化胶条12根。 21号22：30，聚焦电泳12根。 22号8：30聚焦结束。 8:30胶条均衡。 9:20转移第二向。 9:50聚焦电泳12根。 10:20技术讲解及仪器使用。 10:50凝胶固定染色。 11:20胶条水化12根。 K.13:30技术讲解。 L.14:00胶条均衡。 M.14:50转移第二向。 N.15:20胶条水化12根。 O.15:50讲解仪器使用。 P.16:30凝胶固定染色。 Q.22:30聚焦12根。 R.23号8:30聚焦结束。 S.8:30胶条均衡。 T.9:20转移第二向。 U.9:50聚焦电泳12根。 V.10:20技术讲解。 W.10:50凝胶固定染色。 X.11:20胶条水化6根。 Y.13:30技术讲解。 Z.14:00胶条均衡。 14:50转移第二向。 15:20胶条水化6根。 15:50观光染色结果 16:20凝胶固定染色。 16:50讲解仪器使用 附件1：实验报告 附件2：2DE溶液配制 附件3：实验室发布文章 另附：伯楷安 PAGE预制胶使用说明 上海交通大学生化解析与分别实验室 附件1：实验三 双向凝胶电泳分别 IEF标准蛋白 目的要求 （1）经过IEF标准蛋白的分别，理解 2DE分别原理。 （2）认识并掌握 2DE技术的全程操作方法。 实验原理 双向电泳（2DE）是解析从细胞、组织或许其余生物样品中提拿出来的蛋白混杂物最有力和宽泛应用的方法。这项技术利用蛋白质在两次独立的分别步骤中的特征将蛋白质分开： 第一直等电聚焦（ IEF）依据蛋白质的等电点（ pI）将蛋白质分别。第二向 SDS-聚丙烯酰胺 电泳（SDS）中利用蛋白质的分子量（ Mr，相对分子量）大小将它们分别。 等电聚焦（IEF）：各种蛋白质各自都有一个等电点 ,在一特别的 pH环境中,蛋白质分子 呈电中性,在电场中不会迁徙。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质， 当通以直流电时， 两性电解质即形成 一个由阳极到阴极逐渐增添的 pH梯度，在此系统中，不一样的蛋白质即挪动到或聚焦于其相 当的等电点地点上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。（图）。 图2DE原理表示图 SDS：SDS是阴离子变性剂，能将折叠的蛋白质分子打开并以必定的质量比（ 1.4:1） 与蛋白质联合，这样全部的蛋白质都有相像的形状和荷质比， 清除了蛋白质形状和所带电荷 对电泳结果造成的影响，蛋白质分子迁徙距离只跟蛋白质的分子量有关。在电场的影响下，带有SDS的负电荷的蛋白质向正极运动，分子量越大挪动的越慢，反之，挪动的越快。 试剂和器械 一、试剂 IEFstandardprotein(BioRad 公司)，预制胶条 pH3-10（上海伯楷安生物科技有限公司） ， SDS预制胶（上海伯楷安生物科技有限公司） ，二硫苏糖醇（ BioRad公司），碘乙酰 胺（BioRad公司），尿素、tris碱（sigma）。 实验过程中所用溶液配制参照附件文件。 二、器械 等电聚焦仪（上海伯楷安生物技术有限公司），水化槽（BioRad公司），mini垂直板电泳装置（BioRad公司）。 图等电聚焦仪 图SDS装置 操作方法 等电聚焦操作： 拿出IPG预制胶条（7cmpH3-10），室温均衡。 在聚焦盘或水化盘中加入样品。 去除预制IPG胶条上的保护层。 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中。 在每根胶条上覆盖1ml矿物油，水化6-10小时。 将胶条从水化盘中拿出，去除矿物油后，将其放入等电聚焦盘内，对好正、负极，盖上盖子。 设置等电聚焦程序并运转。 胶条均衡： 配制胶条均衡缓冲液I。 拿出聚焦好的胶条，吸去胶条上的矿物油。 10.将胶条放入均衡盘进行第一次均衡。振荡 15分钟。 配制胶条均衡缓冲液II。 进行第二次均衡，振荡15分钟。 SDS操作： 吸去预制胶玻璃板中液体。将玻璃板平放在桌面上。 琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。 均衡结