实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定.docx

实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定 The following text is amended on 12 November 2020. 实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、 目的 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显着増加，植物体内脯 氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测 定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外.由于脯氨酸亲水性极强?能稳定原 生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件 下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指 标。 二、 原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离 于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性曲三酮加热处理后，站三酮与脯氨酸反应，生成稳定 的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含 量的高低。在520皿波长下测定吸光度，即可从标准曲线上査出脯氨酸的含量。 三、 材料、仪器及试剂 材料：植物叶片。 仪器：分光光度计：电子分析天平：离心机：小烧杯；普通试管：移液管：注射 器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架：滤纸；剪刀；洗耳球。 3 .试剂及配制： %酸性苗三酮溶液配制：将前三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol ? L磷酸中，搅 拌加热（70°C）溶解，贮于冰箱中。 3%磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸儒水溶解后定容至100mlo 10卩脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量 蒸馅水溶解，再倒入200ml容量瓶中?加蒸備水定容至刻度（为lOOug-mr1脯氨酸母 液），再吸取该溶液10ml,加蒸饲水稀释定容至100ml,即为lOMg ? ml”脯氨酸标准 液。 冰酷?酸；甲苯。 四、 实验步骤 脯氨酸标准曲线的制作 取6支试管，编号，按下表配制毎管含量为0?12卩g的脯氨酸标准液。 加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30mino取出冷却，各试管再加入 1ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。 试剂 管 号 0 1 2 3 4 5 10 U g ? mF1脯氨酸标准液 0 (ml) 2 蒸馋水（ml） 冰醋酸（ml） %酸性尊三酮（ml） 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 每管脯氨酸含量（Ug） 0 2 4 6 8 10 用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在 520mm波K处测定吸光度（A）值。 标准曲线的绘制 以1?5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 样品的测定 脯氨酸的提取 称取不同处理的植物叶片各，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3%的磺 基水杨酸溶液，在沸水浴中提取lOmin （提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净 的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 测定 吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2nd冰醋酸及2血％酸性茹三酮试剂，在沸 水浴中加热30min,溶液即呈红色。冷却后加入血1甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取 上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min 用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在 520皿波长处测定吸光度（A）值。 五、计算结果 从标准曲线上査出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量: 脯氨酸含量（Pg-g_1Fw）= X X 提取液总量（ml） 样品鲜重（g） X测定时提取液用量（ml） 公式中：X —从标准曲线中査得的脯氨酸含量（Pg） 五、注意事项： 配置的酸性前三酮溶液仅在24 h内稳定，因此最好现用现配。 测定样品若进行过渗透胁迫处理，结果会更显着。 试剂添加次序不能岀错。