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第二章;显微技术;光学显微镜;1.普通光学显微镜;(1)分辨率(resolution，R):显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。 0.61λ R ＝ n · sinθ; R ＝ 0.61λ/n·sinθ n:聚光镜和物镜之间 介质的折射率. 空气为1,油为1.5 θ:标本对物镜镜口 张角的半角. sinθ的最大值为1 λ:照明光源的波长. 白光为0.5 μm ; 光学显微镜最大分辨率计算：;2.荧 光 显 微 镜;;绿色荧光蛋白GFPgreen fluorescent protein;2008年的诺贝尔化学奖授予了从事有关“绿色荧光蛋白质的发现 ;图示： 鼠主动脉平滑肌细胞 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red ;　免疫荧光显微镜技术（Immunofluorescence microscopy）;3. 相差显微镜（直视活细胞）;;4. 暗视野显微镜（观察物体轮廓）;原理: 利用特殊装置使照射光斜照到样品上，照射光无法进入物镜，故呈暗视野。只有从样品发出的散射光才能进入物镜被放大,在暗的背景中呈现明亮的像。 主要观察物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合观察活细胞内的细胞核、线粒体, 以及液体介质中的细菌等微粒的运动 ;5.显微电影摄影 —记录细胞或细胞器运动过程和速度;6.激光共聚焦扫描显微镜;;b1;1.透射电子显微镜 2.扫描电子显微镜 3.扫描探针显微镜 ;1.透射电子显微镜;透射电镜的成像原理;分辨率： 理论上 d = 0.002 nm 实际上 d = 0.1 nm 生物标本 d = 2 nm 放大倍率 1,000,000 ;2.扫描电子显微镜;成像原理;a.样品表面形貌 表面越突出，图像越亮 表面越凹陷，图像越暗 b.样品与集电器的关系 面向集电器，图像越亮 背向集电器，图像越暗;扫描电镜的特点;很强的立体感;样 品 适 应 性 大;（三）扫描探针显微镜;细胞化学技术;细胞化学技术（cytochemistry technique）：在保持细胞结构完整的条件下，通过细胞化学反应分析细胞内各种成份（如生物大分子、小分子、无机离子等）的分布情况以及这些成份在细胞活动过程中的动态变化，即对细胞内的化学成分进行定位、定性和定量分析，从而研究细胞乃至细胞器的结构和功能的关系以及细胞的生理和病理现象的分析技术。 包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、原位杂交技术、放射自显影技术等。 基于光镜和电镜的显示技术;一　酶细胞化学技术　;抗体示踪技术;B. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 抗体???酶;（四）原位杂交技术（in situ hybridization）;细胞的分离和分析技术;离心分离技术，如超速离心： 细胞器、大分子;制备细胞匀浆;离心技术：;2.层析 — 分离蛋白质;⑵柱层析 — 分离蛋白质;A.离子交换层析 B.凝胶过滤层析电荷 　大小;C.亲和层析 D.疏水性层析 亲和 疏水性 基质＋抗体 基质＋疏水基团;应用： 细胞分选: 1000-5000cells/sec;4.电泳 — 分析蛋白质、核酸;(2) SDS—根据蛋白质分子量、 亚单位组成等;; Western-blotting 印迹技术 将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗反应,最终以发色底物显色而被检测. 基本步骤: (1)SDS (2)转膜 (3)抗体反应， 一抗孵育，标记二抗孵育 (4)显色 ;（2）Southern blotting – DNA;;（3）Northern blotting – RNA;细胞培养技术;原代培养(primary culture):直接从生物体获取细胞进行培养。１－10代 传代培养(secondary culture)：将原代培养的细胞连续以一定比例扩大培养。正常组织的细胞在体外传代不超过50代。 细胞系(cell line) ：原代培养细胞经传代成功后即为细胞系。 细胞株（cell strain） ：当培养细胞具有某些特征与标志并能继续培养下去时（具有特定性质或标志的细胞群）称为细胞株。 克隆（clone）：指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生