高通量测序技术及其在农业上的应用.pptxVIP

高通量测序技术及其在农业上的应用农业资源利用一、高通量测序简介二、高通量测序平台的介绍三、高通量测序技术在农业上的应用一. 高通量测序技术1.1 什么是高通量测序技术高通量序技术（next-generation sequencing）是对传统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 1.2 为什么要发展高通量测序技术快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。1.3 高通量测序技术的特点速度快准确度高成本低覆盖度深产出巨大二 高通量测序技术的原理高通量测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。下面对三种高通量测序技术的原理和特点分别进行具体介绍。454 Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸测序：A 磁珠制备设备C 454测序原理B 454测序仪454 测序流程与Base Calling 每次加入一种碱基然后再对荧光强度进行读取。碱基聚合反应产生焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP，ATP在荧光酶催化下激发荧光，荧光强度和焦磷酸的量成正比。454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物(homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。Illumina Solexa简介桥式PCR边合成边测序可逆终止物HiSeq 2000Solexa 的特点与主要应用读长较短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要应用：RNA测序、表观遗传学研究ABI SOLiD 简介SOLiDSequencing by Oligo Ligation/DetectionOligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团进行检测SOLiD 5500xlABI SOLiD测序前期制备A 样品片段化磁珠连接B 乳化PCR3‘末端修饰C 磁珠富集转到测序玻片ABI SOLiD测序原理测序流程依次加入五种引物进行五次测序。加入测序引物及加入oligo连接酶连接，激发荧光检测，循环一个流程，换一种引物再循环一个流程，五个流程结果叠加分析出序列。SOLiD 的特点与主要应用读长较短，50-75bp精度高，可达Q40通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G主要应用：基因组重测序、SNP检测等三种平台的技术差异三、高通量测序技术在农业上的应用 目前，高通量测序技术已广泛应用于动植物全基因组测序、基因组重测序、转录组测序、小RNAs测序和表观基因组测序等方面 。下面对高通量测序技术在农业研究中的一些具体应作以介绍。3.1 全基因组重测序 全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel，Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV，Structure Variation) ， 通过生物信息学手段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。 3.1.1 利用重测序进行进化分析及SNP筛选 Lai 等(2010)对6个玉米( Zeamays) 骨干自交系进行了全基因组重测序，共发现 1273124个单核苷酸多态性位点( SNPs) ，得到30178个1～6bp的插入缺失位点( InDels) ， 新发现的这些SNPs和InDels提供了1个高密度的全基因组标记信息，同时也鉴定出