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透射电子显微镜样品制备 —— 超薄切片技术; 电子束穿透固体样品的能力，主要取决于加速电压和样品物质的原子序数。加速电压越高，样品原子序数越低，电子束可以穿透的样品厚度就越大。透射电镜常用的50-100kV电子束来说，样品的厚度控制在10～100nm为宜。;;超薄切片技术;;;;;;;固 定 剂;多聚甲醛：;戊二醛（glutaraldehyde）：;;四氧化锇（osmium tetroxide）：;;; The packed ?bre segments were post-?xed and stained with 1% osmium tetroxide (OsO4) and 1.5% potassium ferrocyanide (K4Fe(CN)6) in 0.1M sodium cacodylate buffer for 90min at 4?C. The use of reduced osmium tetroxide containing potassium ferrocyanide favours a high electron density of glycogen particles (De Bruijn,1973). (1.5% 亚铁氰化钾溶于0.1M二甲基胂酸盐缓冲液） ;;;;;;固定效果的影响因素：;;缓冲液的选择和缓冲条件 缓冲液的作用：维持稳定的、靠近生理状态的pH条件；提供合适的渗透压条件，使细胞不发生肿胀或收缩；提供适宜的离子条件，使容易不发生抽提或沉淀。 缓冲液的种类：磷酸缓冲液、二钾砷酸钠缓冲液，此外可加入葡萄糖、氯化钠等来调节渗透压。 但合适的固定液渗透压随被固定细胞和缓冲液的种类改变，很难找到一个通用的渗透压。在实际操作中，1.0%-2.5%戊二醛（使用0.1M磷酸盐缓冲液或0.1M二甲胂酸盐缓冲液）在一般情况下，已经能提供理想的固定效果。除非观察到明显的渗透压造成的假象，一般不对固定液专门进行渗透压调节。 缓冲液的浓度：一般0.1M 缓冲液的pH： 一般7.2－7.4 ;;;;;小鼠肝细胞电镜图片;小鼠肝细胞电镜图片;;;;常用包埋剂: 脂溶性包埋剂－环氧树脂（Epon812、Spurr，618树脂）;水溶性包埋剂; 包埋过程：1份脱水剂＋1份包埋剂渗透→1份脱水剂：2份包埋剂渗透→纯包埋剂渗透2/3次→包埋、聚合。前面每一步的时间都在1～2小时，聚合的时间、温度视包埋剂的种类而定。 渗透与包埋过程中的注意事项：（1）一切器材都要干净，烘干、冷却后才可用； （2）包埋剂的配制要充分搅拌； （3）湿度对包埋剂及包埋效果的影响 （4）包埋块的保存;;超薄切片;标本的修整步骤;;钻石刀 玻璃刀;;;;;;铜网的准备;支持膜的制备;;;超薄切片操作步骤;;specimen alignment and approach;specimen alignment and approach;对好刀;Collecting your Sections;Collecting your Sections;; 样品的定位;海马 100倍.JPG;CA3 400倍.jpg;CA2 400倍.jpg;CA1 400倍.jpg;CA4 400倍.jpg;DG 颗粒层 400倍.jpg;;超薄切片的注意事项： （1）对刀是关键，对刀时要耐心、仔细 （2）水槽的污染问题 （3）环境的影响问题 超薄切片常见的缺陷及其消除方法： 破碎——脱水不彻底，有气泡，刀痕，颤痕，厚度不一， 带水 切片不成带，皱缩;切片染色;;染色引起的人为缺陷;;