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2021年甲基绿派洛宁法显示细胞内DNARNA的分布实验报告山东大学 2021年甲基绿派洛宁法显示细胞内DNARNA的分布实验报告山东大学 PAGE / NUMPAGES 2021年甲基绿派洛宁法显示细胞内DNARNA的分布实验报告山东大学 甲基绿——派洛宁法显示细胞内DNA、 RNA分布 【试验目】 学会制作血涂片; 熟悉甲基绿——派洛宁法显示核酸原理与操作步骤; 观察DNA、 RNA在细胞中分布。 【试验原理】 1、 电离作用: 脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基, 又有碱基, 故为两性电解质。在一定条件下, 能够电离而带电荷, 所以都有一定等电点。 甲基绿、 派洛宁为两种碱性染料, 在水中电离后, 都产生带阳电荷离子, 常与带负电荷磷酸根形成盐键。 甲基绿电离后, 在五价氮处产生二个正电荷, 碱性较强, 易与双链DNA分子（胞核等电点pH3.8～4.2）进行极性吸着而结合, 使DNA显示绿色; 派洛宁电离后仅产生一个正电荷, 碱性较甲基绿弱, 与单链RNA（胞质等电点pH4.6～5.2）吸附结合, 使RNA显示红色。 2、 聚合作用: 甲基绿对聚合高DNA有亲和力, 派洛宁对聚合低RNA有亲和力。所以, 甲基绿选染DNA, 而派洛宁选染RNA。 【甲基绿——派洛宁法试验步骤】 1．取蟾蜍（蟾蜍破髓, 仰位剪去下颌、 舌头）制备血涂片, 干燥后滴加70%乙醇溶液固定10分钟, 晾干。 2．滴染色液于血膜上, 染15分钟。（或在染色缸中） 3．蒸馏水冲洗, 去染液。 4．向染色液血膜滴加95%乙醇溶液分色、 同时倾斜载片弃液体, 晾干。 5. 观察。 甲基绿—派洛宁染液配制 试剂: 0.2mol/l醋酸缓冲液（PH4.8） A液: 冰醋酸1.2ml+蒸馏水至100ml B液: 醋酸钠（NaAc·3H2O）2.72克溶于100ml蒸馏水中 使用时, A液与B液按2: 3百分比混合。 甲基绿—派洛宁染液 A液:2克甲基绿加0.2mol/l醋酸缓冲液至100ml。 B液:1克派洛宁Y加0.2mol/l醋酸缓冲液至100ml。 临用时, A液于B液5: 2混合。 甲基绿派洛宁法试剂配制（改良Cook, 1974） （一）2%甲基绿水溶液: 甲基绿（methyl green）1g 蒸馏水加至50ml 用三氯甲烷抽提, 方法详后。 （二）5%派洛宁水溶液: 派洛宁G（pyronine G）1g 蒸馏水加至20ml （三）0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8） 0.2M醋酸液41ml 0.2M醋酸钠液59ml （三）甲基绿派洛宁染液: 2%甲基绿水溶液（经抽提） 5ml 5%派洛宁水溶液 1ml 蒸馏水 12ml 0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8） 18ml 甲基绿派洛宁染液pH值必需严格控制 PH4.8时, 甲基绿与派洛宁分别对DNA和RNA有亲和性, 可获很好结果 PH9时, 甲基绿着色, 派洛宁不着色。 PH极低时, 甲基绿不着色 DNA和RNA染色液（MGP染色液）原理方法: Vnna-Pappenheim氏甲基绿派洛宁法。 适用范围: 适宜组织石蜡切片染色。 产品组成: A试剂（酶染剂）3瓶 B试剂（PMG染料）3瓶 染色方法: 1、 组织切片脱蜡至水。2、 A试剂（酶染剂）染色5分钟; 3、 B试剂（PMG染料）染色10～30分钟; 4、 水洗, 此时切片应呈淡绿色, 若偏红, 可用冷丙酮快速分色; 5、 热风吹干切片, 二甲苯透明, 中性树胶封固。结果参考: DNA呈浅～深绿色, RNA呈粉红色。使用期: 十二个月。贮存: 常温保留。 【试验用具】 材料 蟾蜍 试剂 蒸馏水、 70%乙醇溶液、 95%乙醇溶液。 3．器材 解剖针、 载玻片、 盖玻片、 显微镜、 镊子。 【操作步骤】 取蟾蜍（蟾蜍破髓, 仰位剪去下颌、 舌头）制备血涂片, 干燥后滴加70%乙醇溶液固定10分钟, 晾干; 滴两种染色液分别于两张血膜上, 染15分钟。（或在染色缸中）; 蒸馏水冲洗, 去染液; 向染色液血膜滴加95%乙醇溶液分色, 同时倾斜载片弃液体, 晾干; 观察。 【试验结果】 甲基绿——派罗宁染色液1 甲基绿——派洛宁染色液2 【试验结果分析与注意事项】 分色时间和次数掌控尤其关键, 时间过长或次数过多会造成镜下观察细胞基础没有颜色。 制作血涂片时候, 推片技术和力度等需要掌控好。