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食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 （参考GB4789.10-2016） 一、方法检测范围 本方法规定了食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的检验方法。 本方法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验。 二、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 恒温培养箱:36℃±1℃；冰箱:2℃~5℃； 恒温水浴箱:36℃~56℃；天平:感量0.1g；均质器；振荡器；无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头；无菌锥形瓶:容量100mL、500mL；无菌培养皿:直径90mm；涂布棒；pH计或pH比色管或精密pH试纸。 三、培养基和试剂 7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板见、Baird-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤(BHI)、兔血浆、稀释液:磷酸盐缓冲液、营养琼脂小斜面、革兰氏染色液、无菌生理盐水配制方法见附录。 四、检验程序 金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。 图1 金黄色葡萄球菌检验程序 五、操作步骤 1.样品的处理 称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~ 2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。 2.增菌 将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h~24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。 3.分离 将增菌后的培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18h~24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养24h~48h。 4.初步鉴定 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些, 且外观可能较粗糙，质地较干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色)，菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 5.确证鉴定 5.1染色镜检 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5μm~1μm。 5.2血浆凝固酶试验 挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选)，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18h~24h。 取新鲜配制兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2mL~0.3mL，振荡摇匀，置 36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18h~48h，重复试验。 六、结果与报告 1.结果判定:符合4、5，可判定为金黄色葡萄球菌。 2.结果报告:在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。 附 录 1. 7.5%氯化钠肉汤配制方法 1.1 成分 蛋白胨10.0g；牛肉膏5.0g；氯化钠75g；蒸馏水1000mL。 1.2 制法 将上述成分加热溶解，调节pH至7.4±0.2，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。 2.血琼脂平板 2.1 成分 豆粉琼脂(pH7.5±0.2) 100mL；脱纤维羊血(或兔血)5mL~10mL。 2.2 制法 加热溶化琼脂，冷却至50℃，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。 3. Baird-Parker琼脂平板 3.1 成分 胰蛋白胨10.0g;牛肉膏5.0 g;酵母膏1.0 g;丙酮酸钠10.0 g;甘氨酸12.0 g; 氯化锂(LiCl·6H2O)5.0 g; 琼脂20.0 g;蒸馏水950 mL 。 3.2 增菌剂的配法 30%卵黄盐水50mL与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液10mL混合,保存于冰箱内。 3.3 制法 将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.0±0.2。分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至