基因重组及遗传分析.pptxVIP

第五章 细菌基因重组及遗传分析;;第一节 转化（Transformation）;感受态的出现 ;;;DNA在进入感受态细胞之前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。 可逆吸附的DNA对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不可逆吸附DNA对DNA酶不敏感。 ;吸附到细胞表面是双链DNA，而不是单链DNA;流感嗜血菌特异性摄取序列： 5’AAGTGCGGTCA 3’ 淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：5’GCCGTCTCAA 3’ 在流感嗜血菌的染色体上有600个拷贝的摄取序列。摄取序列虽然只有10-12bp，???很少随机地出现在其他物种的DNA序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。;;转化为相同或相近物种之间的同源重组提供了可能性，是自然界中基因交换的一条重要途径，在生物变异和进化中起着重要作用。;二、人工转化 ;1970年Mandel和Higa首先发现DNA在含有高浓度Ca2+的条件下能够被受体细胞摄入和转化，随后的实验证明由Ca2+诱导的人工转化的大肠杆菌中，其转化DNA必须是一种独立DNA复制子。;先将大肠杆菌培养至OD600=0.5～1 接着用50-100mmol／L CaCl2处理制备成感受态细胞 然后将DNA与感受态细胞混合 在冰浴中反应20-40min 进行42℃热击可增加DNA的吸收（107个转化子/ug质粒DNA ）;PEG介导的转化;电脉冲法（电穿孔法 ）;基因枪(biolistic)转化 ;三、建立转化方法的策略 ;四、转化应用 ;2. 遗传图谱的绘制;3. 基因中断;4. 插入基因;第二节 接合作用（conjugation） ;;混合培养后在基本培养基中出现的原养型菌落是否是杂交的结果？ 必须要排除下列几种解释： 一是细菌细胞并没有接合，而是交换了DNA(转化作用) 二是细胞并未接合，而是通过培养基交换了养料(互养) 三是细菌细胞并未接合而是亲本发生了回复突变;当时Lederberg和Tatum已经证明，当把A菌株的培养液经过灭菌，再加入到B菌株的培养液中，没有原养型菌落，这说明上述实验并非转化的结果。 1950年，Davis通过他的U形管试验进一步支持了Lederberg和Tatum的结论。;营养缺陷型细胞通过培养基交换养料而生长的现象亦称为互养。;因为大肠杆菌的突变率一般都10-8，若两个基因同时回复突变，则其可能性只有10-16（10-8×10-8），这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培养能出现10-5~10-6频率的菌落一定是重组的结果。;4. 遗传物质的单向转移 ;把A菌株认为是供体，而B菌株是受体 A菌株作为遗传物质的供体，当链霉素对它进行灭活以后，并未影响它传递遗传物质的能力。 B菌株作为遗传物质的受体，一旦被链霉素杀死以后，必然不能出现重组体。;StrrA突变型（不育变种）⊙;① 大肠杆菌的供体或雄性细胞(如A菌株)记为F+，带有一个性因子或致育因子F (fertility factor)，而另一个不带性因子F的受体或雌性细胞(如B菌株)叫做F-； ② 杂交F+×F-是可育的，杂交F-×F-是不育的； ③ F因子可以传递，从F+到F-细菌，但必须通过细胞接触 ④ F因子能够自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从另一个F+细胞再把它传递过来。;F因子是染色体外的一种遗传结构，也就是质粒(plasmid)。 ;二、F质粒的结构及其在细胞中的存在状态 ;长度为33 kb，由23个基因组成，构成一个tra操纵子(tra operon)。 tra ABCEFGHKLQUVW与性菌毛的形成有关 tra YZMIGD等与F因子的转移有关 traG、traN 影响杂交对的配对形成与否 traI、traM 决定DNA转移起始 traI 编码解旋酶I(helicaseⅠ) traD 控制DNA转移； traY、traZ 编码的核酸内切酶能在转移起始区 oriT上切开一个缺口。;复制区负责F质粒的自我复制 F质粒自主复制区为oriV（Vegetative origin of replication），在oriV中包含有复制起点。F质粒的复制是按θ型方式进行复制，它是一种严紧型质粒。 F质粒的拷贝数能被精确地控制，一个寄主细胞约有1~2个F质粒。rep（F replicative protein）编码一组与F质粒复制相关的蛋白质。 inc（incompatibility）基因产物使细胞具有不相容性。;F质粒插入区包含4个插入顺序： 2个IS3 1个IS2 1个Tn1000（γδ） 它们与F质粒的整合、切除、易位有关 ;2. F质粒在细胞内的存在形式