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6、蛋白质分离纯化及分析Protein Isolation and Assay ;蛋白质分离纯化方法 蛋白质的分离纯化基于蛋白质的理化性质 沉淀、透析和超滤、离心、电泳、色谱 蛋白质性质分析 蛋白含量及纯度测定、分子量测定、等电点 序列测定、结构测定 活性分析 蛋白质组学;蛋白质的分离纯化基于蛋白质的理化性质;蛋白质分子量很大，一般在10 000 – 1000 000之间，在水溶液中分子直径在1-100nm之间，具有胶体溶液的性质，如不能通过半透膜、电泳现象等。因此可用透析和电泳的方法来分离、纯化蛋白质。 利用蛋白质不能通过半透膜，而小分子杂质可以通过半透膜的性质，将蛋白样品置于半透膜中，在流水中不断透析以达到纯化蛋白质的目的。超滤的原理和透析类似。 ;蛋白质分离纯化方法;加入高浓度的中性盐（如[H4N]2SO4、Na2SO3 、NaCl等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质产生沉淀。这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析(salting out)。盐析法是最常用的分离蛋白质的方法。;盐溶（salting in）：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。由于蛋白质分子吸附某些盐类离子后，带电表层使蛋白质分子相互排斥，而蛋白质分子与水分子的相互作用加强，因此溶解度提高。;常用的中性盐有[H4N]2SO4、Na2SO3 、NaCl等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。 用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。;可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。 调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加速蛋白质沉淀。 常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质。;当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀的蛋白质常是变性的，误食重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。;pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸) 生成不溶性盐而沉淀。 血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 ;2 蛋白质透析和超滤;3 离心;已测得许多蛋白质的s值都在1×10-13-200×10-13秒之间。因此，采用1×10-13秒作为沉降系数的一个单位，用S(Svedberg unit)表示。 例如：某蛋白质的沉降系数为30×10-13秒，可用30S表示。用超速离心法测得某种蛋白质的沉降系数之后，则可按照一定的公式，计算出该蛋白质的相对分子质量。 转速,rpm（rotation per minute） ;4 电泳;电泳的装置 ;电泳的结果 ;等电聚焦 ;SDS电泳;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）的原理 SDS使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原），使蛋白质变性。 由于SDS是带有负电荷的分子，它通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS，大的蛋白质按比率可以结合更多的SDS。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。;;在蛋白质样品加到凝胶上后，接通电源，所有SDS-蛋白质复合物都向着阳极迁移。由于它们通过凝胶的速率与它们分子量的对数成反比，大的蛋白质会遇到更多的阻力，因此它们迁移的速度比小的蛋白质慢，这实际上是一种分子筛效应。由此就造成了各种蛋白质的迁移率的不同，结果反应在电泳后的凝胶上。;;双向电泳 ;双向电泳结果 ;5 色谱;凝胶层析（凝胶过滤，分子排阻层析） 大分子快，小分子慢;;离子交换层析;;亲和层析;HPLC层析系统;蛋白质分离纯化的一般原则 ①前处理 以适当方式将组织细胞破碎，使蛋白质以溶解状态释放出来，并保持其天然构象和原有生物活性。 动植物组织一般可用组织捣碎机、匀浆器和超声波破碎法；植物组织用研磨或用纤维素酶处理；微生物细胞用超声波法、高压挤压或溶菌酶处理。