内蒙古大学基因的工程大实验开的题目报告材料-绿色荧光蛋白.doc

学号 内蒙古大学生命科学学院生物系 基因工程实验室 本科基因工程大实验开题报告 论文题目:绿色荧光蛋白基因表达载体的构 建及在大肠杆菌中的表达 学生姓名： 年 级： 专 业: 生物技术 指导教师： 苏慧敏 2012年7月30日 学生姓名论文题目民族性别 学生姓名 论文题目 民族 性别 出生年月 绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 开题时间 2012年8月18日 结题时间 2012年8月30 日 项目来源本科生基因工程大实验课 项目来源 本科生基因工程大实验课 一、立论依据 “绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达” 项目的选题和研 究的意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处： 绿色荧光蛋白(gree n fluoresce nt protei n, GFP最初是从多管水母(Aequorea victoria )中发现的一种蛋白质。当水母发光蛋白结合 CeT后发出蓝色荧光，该 蓝光进一步激发绿色荧光蛋白产生绿色荧光。 绿色荧光蛋白激发后发出的荧光 持续时间较长，且不需要任何其他辅助因子的作用。绿色荧光蛋白能在多种生 物，如细菌、粘菌、酵母、植物和哺乳动物中表达并产生荧光。绿色荧光蛋白 的这一种属不依赖的特性使其成为能被广泛运用的荧光标记分子 ⑴0野生型绿 色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa而编码GF的基因序列也很短。GFP 由238个氨基酸残基组成。GF序列中的65-67位残基(Ser-Tyr-Gly)自发形成对 羟基苯咪唑啉酮基团而可以荧光发色[4] 0 在1994年发现绿色荧光蛋白后，国内外对绿色荧光蛋白的研究进一步发 展，目前在基因表达中可以利用绿色荧光蛋白进行基因整合、 细胞分选及转基 因动物的研，根据其颜色的特殊性在细胞生物学中作为荧光标记用于细胞动态 的研究，在活细胞中可以利用其进行蛋白的定位，在 western blotti ng 中可 作为一种体外检测手段[2] 0 在随着分子生物学理论与技术的发展，对绿色荧光蛋白的理论研究进一步 深入，并且绿色荧光蛋白在分子生物学领域的应用进一步加强 ，绿色荧光蛋白 工程,包括绿色荧光蛋白蛋白工程和绿色荧光蛋白基因工程的迅速发展 ，尤其 绿色荧光蛋白基因作为新型报告基因越来越受到关注，目前已经应用GFP作为 选择标记基因成功构建多种表达外源基因的重组质粒 [2] 0 绿色荧光蛋白如要在各领域得到更加完整全面的应用，至少还需要几个 条件：基础理论体系的成熟完善、新型优良突变体的诞生以及与各种现代生物 技术的融合。与此同时，随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟，我们 有理由相信，绿色荧光蛋白一定会给我们带来更多的应用价值，并进一步揭开 生命的未解之谜[3] 大肠杆菌(Escherichia coli )遗传背景清楚，培养方便，转化效率高， 繁殖快,而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，因此大肠 杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 大肠杆菌中存在的Lac启动子受分 解代谢系统活化蛋白和CAMP的正调控和阻遏物的负调控，当加入IPTG可与阻 遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变，阻遏蛋白不再能与操纵基因结合， 从而使结构基因表达，便于进行筛选。 本实验研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-trx-EGFP-N3，将重组质粒导入大肠杆菌体内， 通过酶切、电泳及IPTG诱导检测是否成功诱导表达。根据电泳结果及荧光现 象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 张峰，任燕，陆长德《绿色荧光蛋白及其应用》 1994.4生命科学第11卷 第2期 王晓丽，邵卫星，单虎《绿色荧光蛋白研究进展》动物医学进展， 2008.29 （1）： 58 吴沛桥，巴晓革，胡海。赵静《绿色荧光蛋白 GFP的研究进展及应用》 生物医学工程研究2009,28 （ 1）： 86 Cody CV，Douglas CJPWiUiam MWt al，Biochemistry,1993,32（5）:1212-1218 二、实验方案 1 ?实验内容和实验目标，拟解决的关键问题： 1.1实验内容： 1.1.1载体pGEX-4T-1质粒DNA的小量制备 从超低温冰箱中取出保存pGEX-4T-1载体的菌种和pEGFP-N3勺菌种，超 净台中接种后37C恒温摇床扩增；之后取少量菌液离心留沉淀备用，依次加 入相应试剂提取质粒，进行凝胶电泳鉴定，之后在pGEX-4T-1质粒中加入适量 RNaes A 1.1.2质粒DNA电泳鉴定 制备电泳缓冲液，将适量的胶倒入凝胶灌制模具，待胶完全凝固，点入样 品，将电泳仪调到适当的电压，电泳进行一段时间后，将带有样品的凝胶小心 放入盛有EB的盒中，染色五分钟，取出样品用