激光扫描共聚焦显微镜的基本原理及其使用技巧 (1).pdfVIP

第３４卷 第２期 电　 子　 显　 微　 学　 报 Ｖｏｌ３４，Ｎｏ２ ２０１５年４月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１５⁃０４ 文章编号：１０００⁃６２８１（２０１５）０２⁃０１６９⁃０８　 　 激光扫描共聚焦显微镜的基本原理及其使用技巧 １，２，３ １，２ ∗ １ １ １，２ ３ 李　 叶 ，黄华平 ，林培群 ，崔艳梅 ，李勤奋 ，郑勇奇 （１． 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口５７１１０１； ２． 农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室，海南儋州５７１７３７ ３． 中国林业科学研究院林业研究所国家林业局森林培育重点试验室，北京 １０００９１） 摘　 要：介绍了激光扫描共聚焦显微镜（ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＬＳＣＭ）的原理和构造，分析了ＬＳＣＭ 的 优点和缺点，并以花粉为例，详细介绍了共聚焦针孔直径、光电倍增管检测器增益、激光强度、扫描速度、扫描方式 和Ｚ轴步距等重要参数设置对共聚焦成像的不同影响。 探讨了正确使用ＬＳＣＭ 的方法与技巧，如获取高质量的图 像、图像保存及图像处理，以便为科技人员利用ＬＳＣＭ开展更多植物学与环境科学相关的研究提供参考。 关键词：激光扫描共聚焦显微镜；三维重建；花粉；针孔直径；激光强度；图像处理 ＋ 中图分类号：ＴＧ１１５２１ ５；Ｑ３３６　 　 文献标识码：Ａ　 　 ｄｏｉ：１０３９６９／ ｊ．１０００⁃６２８１２０１５０２０１５ 　 　 激光扫描共聚焦显微镜（ＬＳＣＭ）在环境科学、 １　 共聚焦显微镜的发展 材料科学、生命科学等领域中的应用越来越受到重 视，它以高端光学显微镜为核心，配置激光光源又增 共聚焦显微镜的发明起源于 １９５７ 年，Ｍｉｎｓｋｙ 添了精密扫描装置、共轭聚焦装置和多种检测系统 Ｍａｒｖｉｎ首次在他的专利中阐明了激光扫描共聚焦显 而形成的共聚焦显微分析仪器，是２０ 世纪８０ 年代 ［５］ 微镜技术的某些基本工作原理 。 由于当时没有 ［１］ 发展起来的一项高新技术 。 它除了具有高分辨 足够强度的光源，导致图像质量不太理想，因而没有 率、高灵敏度、高放大率等特点外，还可以观察动态 引起太多人的关注。 １９６７ 年，Ｅｇｇｅｒ 第一次成功地 和静态标本与组织的深层内部微细结构，它不仅可 用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。 它的成功 以得到清晰锐利的显微 ＣＴ 图像（光学切片），且经 源自尼普科夫盘的发明和拉曼光谱学理论的建立。 过３Ｄ重建后，还能够测量分析出细胞形态学参数 但由于尼普科夫盘在设计中技术尚不成熟，在实际 ［２］ ［６］ 和荧光强度等 ，故在形态学、分子细胞生物学、遗 的应用中有着较大的缺陷 。 １９７７ 年，Ｗｉｌｓｏｎ在前 传学、环境科学、生物化学、植物学、食品学和病理学 人研究的基础上，结合构成共聚焦成像的几何学的 ［３，４］ 等研究领域中得到了越来越广泛地应用 。 但 基础理论，首次描述了光与被照明物体的原子之间 是，对于许多第一次接触ＬＳＣＭ 的初学者，可能会遇