激光扫描共聚焦显微镜的使用及维护.pdfVIP

医疗装备２０１６ 年８月第２９ 卷第１６期Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ａｕｇ.２０１６，Ｖｏｌ.２９，Ｎｏ.１６ ·使用与维修 · 激光扫描共聚焦显微镜的使用及维护 赵婵娟，袁粒星 （通信作者） 四川大学华西第二医院 （四川成都 ６１００４１） 〔关键词〕激光扫描共聚焦显微镜；荧光；Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００ 〔中图分类号〕ＴＨ７７３ 〔文献标识码〕Ｂ 〔文章编号〕１００２－２３７６ （２０１６）１６ －００４０－０２ 激光扫描共聚焦显微镜 （ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏ- 光）、ＣＹ２ （绿色荧光）、ＣＹ３ （红色荧光）染色的单色图，ｄ ｓｃｏｐｅ，ＬＳＣＭ）简称共聚焦显微镜，普遍用于荧光成像和细 为三种颜色合成到一起的合成图。（２）利用ＬＳＣＭ对样品进行 胞分析，它成像清晰、放大倍数大、分辨率高，是生物医学 空间断层和时间序列的扫描 （ｘｙｚ ，ｘｙｔ），通过软件处理后得 领域中强有力的研究工具［１ －２］。本研究以日本的 Ｏｌｙｍｐｕｓ 到标本的三维实体结构和ａｖｉ 动态视图。（３）Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００ ＦＶ１０００ 为例，介绍激光共聚焦的基本使用及日常维护。 计算机系统可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度、区域 １ 基本原理及应用 内荧光总量等参数进行定量分析，对Ｚ轴扫描的图像可进行体 ＬＳＣＭ在传统光学显微镜的基础上加装了激光扫描装置， 积、深度等参数的定量分析。（４）Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共聚焦还 用激光作为光源，采用共轭聚焦原理，经计算机处理后得到 可以在不改变物镜的情况下对标本进行放大扫描，即使用软 细胞或组织内部微细结构的荧光图像。它与传统场式照明显 件上放大因子 （ｚｏｏｍ ｆａｃｔｏｒ）来操作，但要求放大的倍数不 微镜相比的最大优势在于可以控制焦深和激光强度，降低非 能太大，否则会降低图像质量，通常６ 倍以下可正常使用。 焦平面光线噪音干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，从 （５）通过软件还可以调节系统的激光功率 （ｌａｓｅｒ）、ＰＭＴ 电 ［３］ 而增加了分辨率，提高了标本的清晰度 。利用 ＬＳＣＭ检测 压 （ＨＶ）、电子增益 （ｇａｉｎ）、背景补偿 （ｏｆｆｓｅｔ）和针孔大 的前提是样品需用荧光染料进行标记，荧光染料可直接与细 小等参数，控制扫描速度，选择合适的分辨率等，从而得到 胞内的成分相结合，也可先用荧光染料标记抗体，再用标记 更好地图像。通常激光功率越大，图像越亮，但样品荧光也 有荧光染料的抗体与细胞内的抗原成分特异结合。在研究中， 越容易被淬灭，所以激光功率要尽可能小；探测针孔越大， 可以用一种或多种荧光染料进行标记。这些不同的荧光染料 进入光检测器的信号越多，当荧光信号非常弱时，可适当增 具有不同的特征，在不同的激发光下可以产生不同波长的荧 大探测针孔；增加系统增益会降低图像质量，因此尽量不增 光，可被ＬＳＣＭ计算机系统识别和分析后输出不同颜色的荧 加增益；降低扫描速度和增加扫描次数可使图像信噪比提高， 光图像。本实验室的Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００ 的激光配置有５ 种光 但也越容易发生光漂白，因此通常选择标准扫描速度。 源，分别为４０５ ｎｍ、４８８ ｎｍ、５１５ ｎｍ、５５９ ｎｍ和６３５ ｎｍ。此 外，通过在激光整合器后部引入声光调制滤光片系统，共聚 焦可以同时控制各个波段激光的照射强度或者同一波段激光 在任意时间的照射强度，从而通过时间与空间图像的对应关 系进行特殊的实验研究 ＬＳＣＭ还可用于活细胞生理信号，离 子含量的实时动态分析监测，黏附细胞的分选，细胞激光显 ［４］ 微外科和光陷阱技术等 。 ２ 标本的制作及要求 ＬＳＣＭ检测不会对标本造成物理或化学特性的破坏，因 此标本可以是固定的细胞或组织，也可是活的细胞或组织， 细胞应培养在共聚焦专用小皿或盖玻片上，使用的盖玻片厚