激光共聚焦扫描显微镜与多光子激光扫描显微镜之比较.pdfVIP

塑竖壁堂壹箜童程堂焦堂塑!螋!生整!i鲞筮2塑 287 激光共聚焦扫描显微镜与多光子激光扫描显微镜之比较 张向阳1 门金娥1 师兴安2 (1河北省邯郸医学高等专科学校中心实验室0560292．河北省邯郸煤气公司医务室) 39 A (中圈法分类号】R197 【文献标识鸸J 【关麓词】 激光共聚焦扫描显微镜 多光子激光扫描显微镜 激光共聚焦显微镜是80年代随着光学、视频、计算机 2激光共聚焦显微镜是单光子激发，在整个扫描焦平面以 等技术的飞速发展而诞生的新一代显微镜。自从1957年马及扫描上下都产生荧光的激发，采用与照明针孔共轭的探测 文·闵新基在他的美国专利上首次阐明扫描共聚焦显擞镜技 针孔，使焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，从而提高 术的幕些基本原理，激光显微镜技术得到逐步发展。1970了显微镜的分辨率，但与此同时，在生物样品的整个扫描面 年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共 及扫描面上下．造成荧光大范围的澈发，从而导致整个组织 聚焦显微镜“J，它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光 的广泛漂白和光动力学损伤。多光子激光扫描显微镜采用多 扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或激光澈发 光子激发，这是一个菲线性过程，具有准确的定位特征，也 荧光搽针。能够得到细胞或组织内部锻细结构的荧光图像， 就是只有在焦点处的光于才能激发荧光分子．光漂白和圯损 由于它采用激光作光源，发射角小，方向性好，在发射光检 伤仅局限于焦点附近，且有利于减少测试样品的自发荧光． 测光路上放置了一个与人射光针乳共轭的检测针孔，使焦平 这样可以对活细胞进行更长时间的观察。 面的光可以通过检测针孔，而来自焦平面上、下的光被阻挡 3激光共聚焦扫描显微镜因为有荧光大范围的激发，所肚 在针孔的两边。因此，可得到高清晰度的图像。目前，激光 需要共焦针孔来选择荧光。多光子激光扫描显微镜的荧光激 共聚焦显微镜已发展到拥有12通道，0’～360’旋转扫描，发只发生在焦点，不需共焦针孔选择荧光．因此测量光路更 配以微幼步进马达控制载物台的升降，对样本进行无损伤光 加简单、可靠、有效，设备简单易携，故障率低。 学切片，获得其三维立体结构可在亚细胞水平上观察请如 4多光子激光扫描显徽镜出激光共聚焦扫描显微镜具有更 (岔+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化．成为准确的定位，因而保证了更高的三维分辨率，使背景的干扰 形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领 相对减少，进一步提高了图像清晰度。 域中新一代强有力的研究工具。但激光共聚焦显檄镜存在如 5多光子激光扫描显徽镜的荧光波长远离激发光波长，甚 下问题：(1)要求共聚焦即照明针孔与探测针孔共轭；(2)此多光子显微镜可实现暗场成像。 探针对样品深度的干扰；(3)样本遭到光漂自作用和光致毒 6激光共聚焦扫描显徽镜在生物医学方面经常应用于细胞 作用”J。多光子激光扫描显傲镜的应用使这些问题迎刃而 内游离钙测量，细胞内pH测量、荧光原位杂交分析，免疫 解。多光子吸收的历史可追溯到1931年，当时M．G．M卣盯组化，膜的流动性，胞间通讯等方面。多光子激光扫描显礅 做出了高光强度下多光子吸收会发生的理论预断”】．196j镜除具有上述功能井，在以下方面有警更多的应用：在特制 年在贝尔实验室用脉冲红宝石激光器激发锖离子荧光时首次 的培养皿上可杀死或移动不需要的细胞，分离单层贴壁细 观察到双光子吸收，1989年在美国康奈尔大学w．Denk、胞，在细胞生长表面作微区划分，长时间观察细胞生长．建 J．H．st—ck盯和w．w．webb制成第一台多光子激光显徽镜。立维护混合组胞体系，进行肿瘤移植，控制细胞生长速度． 此后，多光子激光显微镜在生物医学领域发挥了重要的作 建立稳定的细胞系，建立细胞原代培养，进行药物筛选。 用。现将两者作简单比较。 参寿文献 l 多光子激光扫描显微镜采用飞秒激光