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PCRHPVDNA荧光定量检测标准操作程序 PCRHPVDNA荧光定量检测标准操作程序 PCRHPVDNA荧光定量检测标准操作程序 单位及实验室名称 项 目 编号： ASJYK-LAB-C-P-53 HPV-DNA 扩增荧光定 日期： 2021 年 6 月 21 日 版本：第一版，第 1 次修订 检验科 量检测标准操作程序 第 1 页，共 3 页 1.目的：明确高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确 进行巨细胞病毒核酸定量的检测。 2.适用范围： 适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。 适合仪器： LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪 方法原理：采用 PCR方法结合荧光探针的扩增技术 样品要求：宫颈脱落细胞 3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4.试剂来源： 潮州凯普生物化学高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂 盒。 5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6.标准操作： 试剂准备〔在试剂准备区操作〕 6.1.1 将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻〔临用前取出，用后立即放回冰箱， 反复冻融不可超过三次〕 ，取出 PCR MIX,室温下避光解冻， 上下颠倒混匀后， 8000 / 分钟 10s 从试剂盒中取出 DVA聚合酶， 8000 转/ 分钟 lOs。 根据当次实验标本量， 取出相应试剂 〔1 管= MIX + DVA聚合酶〕总的需求量于一管中〔其余随即放回原温度保存〕 ，如所需要的管数为 n (n=标本数 +1 空白管对照 +1 管阳性对照 ) 取 PCR反响管转移至样本制备区。 样本处理 (在样本处理区进行 ) 取宫颈脱落细胞样本 0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到 2m1) 13000 转 / 分钟离心 1 分钟 弃上清，参加细胞保存液重悬细胞 13000 转 / 分钟离心 1 分钟，尽量弃干净上清 每样本参加 50ul 细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸 10 分钟。 13000 转/ 分钟离心 10 分钟，保存上清备用 (上清中为释放的 DNA)。 取上清作为 PCR扩增的模板，其余保存于一 20℃ 在对应的 PCR反响管中分别参加 2ul 处理好的样本 DVA,空白对照、阳性对照，盖 紧管盖，稍做离心 (反响总体积为 2o u 1/ 人份，每次反响需要设置一个阳性对照 以及一个空白对照 )。转移到检测区，放入相应的荧光 PCR检测仪内，记录样本 摆放顺序 PCR扩增〔在扩增区操作〕 6.3.1 翻开稳压器电源，再翻开计算机电源。 6.3.2 翻开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。 设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光 ;Passive Reference选择 none(见表 ASJYK-LAB-C-P-53 第 2 页，共 3 页 1) 表 1: 设置四种荧光检测通道 Detector Name Target Reporter Dye Quencher FAM 12 种高危型 HPV FAM none (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 66， 68) HEM HPV16 HEX/JOE none ROX HPV18 ROX/Red 610 none Cy5 β-globin Cy5 none 将循环条件设定为 Program Cycles ℃ ) Incubation TemperatureAcquisitonAnalysis Temperature ( Time Transition Mode Mode (min:sec) Rate (℃ /sec) 1 1 95 10:00min 20 None None 95 15sec 20 None None 2 45 60 60sec Single Quantification 3 1 38 5sec 20 None None 检查反响管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 将待反响的 PCR反响管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中 设定好样孔位置。 ASJYK-LAB-C-P-52 第 3 页，共 3 页 按仪器操作规程开始循环。 扩增结束后取出 PCR反响管，关闭扩增仪电源，反响管直接放入燃烧垃圾桶内。 分析数据，在 Analysis Notes 窗口中注明检测基线值、试剂批号、阳参批号等相 关信息，进行结果分析。 关闭计算机。 检验结果判断： 基线，阂值的设定 :基线确实定为 :取 3-15 个循环的荧光信号 :阈值设定 :使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线 (无规那么的噪音线 )的最高点，且 Ct 值为 Under 质控对照 1 阴性对照 Ct 值均应显示为 Undet 2 阳性对照