植物基因工程中的λ噬菌体载体.pptx

植物基因工程中的λ噬菌体载体2013年6月29日载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的基因需要采用不同的载体。组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：　质粒　λ噬菌体　柯斯质粒(cosmid)　m13单链噬菌体。噬菌体(bacteriophage，phage)简介噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒，结构简单、基因数少，是分子生物学与基因工程的良好实验系统。噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内。噬菌体具有高效率的感染性和自主复制繁殖性能，使它能高效导入受体细胞，并能使携带的外源基因在受体细胞中高效扩增，所以噬菌体被开发成基因工程的有用载体。噬菌体分类毒性噬菌体（virulent phage）　：吸附、穿入、生物合成、成熟、　　释放温和噬菌体（temperate phage）　：转导、溶源性转换噬菌体温和噬菌体可有三种存在状态：溶菌周期的具有感染性的游离噬菌体颗粒；溶源周期的前噬菌体；宿主菌细胞质内的游离噬菌体核酸。DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体有：单链M13噬菌体载体；λ噬菌体载体；P1噬菌体载体；噬菌粒载体；等等。其中使用最多的是入噬菌体。λ噬菌体λ噬菌体是温和噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp）。右臂：长约10kb，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。中段：从J到N长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列 ，但非溶菌生长所必需左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 基因组长约50kb ，至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 cos位点（cohesive end site）在λDNA双链分子的两个5’ 端各有12个核苷酸单链的互补粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当λ噬菌体感染宿主细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点。如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。 当噬菌体感染宿主细胞后, 双链DNA 分子通过cos 而成环状。在感染早期, 环状DNA 分子进行转录。在此期间, 噬菌体有两条复制途径可供选择: 一是裂解生长。环状DNA 分子在宿主细胞里复制若干次, 合成了大量的噬菌体基因产物, 形成子代噬菌体颗粒, 成熟后使细菌裂解, 释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。另一是溶源性生长。噬菌体DNA 整合进宿主菌的基因组,然后像细菌染色体上的基因一样进行复制, 并传递给下一代细菌。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组λ-DNA分子大小只能在39—52kb之间。 λ噬菌体的繁殖方式在感染的细胞内, 噬菌体有两条复制途径: 1、裂解生长2、溶源性生长DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。λ噬菌体载体的构建构建方式：1、插入型。只具有一个限制酶位点，可便于外源DNA插入，这种载体叫插入型载体（insertion vectors）。2、置换型。含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代。这种载体叫置换型载体（replacement vectors）。至今已用噬菌体开发出许多插入型和置换型载体插入型载体:?ZAP,ZAP,?gt10,gt11等置换型载体:?GEM-11,?GEM-12,EMBL3,EMBL4等构建过程野生型λ噬菌体DNA必须经过改造才能成为理想的载体，其构建过程主要有：①删除基因组中非必需区，建立外源DNA片段的替换点，增加承载外源DNA片段的容量。②在非必需区内插入或替换选择的标记基因和目的基因。③建立重组λDNA分子的体外包装系统，使之有效地感染受体细胞。简而言之，将目的基因插入或替换进入病毒基因组的可替代区，再利用病毒的侵染性，将目的基因导入受体细胞，这就是病毒作为“分子运输车”的基本机理。?λ噬菌体载体的应用一、建立cDNA文库　噬菌体载体系统是在eDNA文库构建中最早使用的载体系统，其主要优点是插入片段的装载