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- 2021-09-15 发布于上海
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测序方法原理:
在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger 双脱氧链终止法(Chain Termination Method)。
概念:
Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的 碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的 PAGE胶上 电泳进行检测,从而获得可见的DNA碱基序列。
原理:
利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链 终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种 脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的 双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的 链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的 核苷酸上,可通过高分辨率 变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片 放射自显影或非 同位素标记进行检测。
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