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体内药物分析方法建立和验证 体内药物分析方法建立和验证 3. 伍用药物的干扰 TDM 时 ——还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰 比较——待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 ——如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致 确证——同时服用药物对分析方法的干扰情况 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内药物分析方法建立和验证 4. 与参比方法的相关性 除上述方法外，有时还可使用参比方法对照 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法 ——如在TDM中使用UV(或RIA)时, 可以HPLC(或GC)为参比 参比方法测定结果为横坐标(X); 拟定方法结果为纵坐标(Y) 用最小二乘法计算回归方程 Y＝a＋bX (坐标标度相等) 相关系数(r)——表示两种方法测得结果的一致性 ——若 r ≠1，表示拟定方法为非线性，如 RIA 中抗血清滴度选择不当 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内药物分析方法建立和验证 4. 与参比方法的相关性 Y＝a＋bX 截距(a) ——表示拟定方法受到恒定干扰的程度——内源性物质(UV) 斜率(b) ——表示拟定方法受到比例干扰的程度——标记抗原不纯(RIA) 与参比方法的相关性比较——除显示分析方法的特异性外 ——斜率b表示两种方法测得结果的一致性 若参比方法准确度良好 ——若截距a≈0, 则拟定方法的准确度(回收率)为100b(%) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内药物分析方法建立和验证 二、标准曲线与线性范围 标准曲线（standard curve）—— calibration curve or working curve ——生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度） ——通常用回归分析方法所得的回归方程来评价 ——除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式 ——回归分析法为最小二乘法（least squares） 或加权最小二乘法（weighted least squares） 线性范围（linear rang）——标准曲线的最高与最低浓度的区间 ——模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内药物分析方法建立和验证 二、标准曲线与线性范围(续) 标准曲线——用模拟生物样品建立 ——线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度 ——不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度 建立标准曲线所使用的模拟生物样品 ——应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内药物分析方法建立和验证 标准曲线的一般建立方法 1. 标准系列溶液(非生物基质溶液)的制备 溶剂——水或甲醇（或其他适当溶剂） 浓度——标准模拟生物样品中药物浓度的 50倍以上 加入量为生物样品总体积的 2%以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异 浓度较低——应除去溶剂后再加入生物基质 否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内药物分析方法建立和验证 2. 标准系列溶液的浓度范围 至少含5～8个浓度点(不包括零点,即空白) ——可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常数约为 2) 若体内平均达峰浓度为50，其1/20为 设定最高浓度为100，最低浓度为1 (个体差异) 实际制备时：500、250、100、50、20、10 …… 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内药物分析方法建立和验证 3. 标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质(如血浆)——加入标准系列溶液适量，涡旋混匀 为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失 ——①先加入标准溶液 ③ ②再加入空白生物基质 ③涡旋混匀 　①　　　　　② 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 体内药物分析方法建立和验证 4. 标准曲线的绘制 以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高)