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医学免疫学实验指导：免疫细胞的检测 内容 实验 、外周血单个核细胞的分离与纯化 试验 、E玫瑰花结试验 试验 、溶血空斑试验 试验 、外周血单个核细胞的分离与纯化—密度梯度离心法 （isolation and purification of peripheral blood mononuclear cell） 人体外周血单个核细胞（主要包括淋巴细胞和单核细胞）与血液中的其它成分存在密度差异，红细胞与中性粒细胞的比重是1.092，单个核细胞约为1.075~1.090，血小板约为1.032。市售的淋巴细胞分层液的比重为1.077±0.002g/L，与单个核细胞比重相近。通过离心后，各种血液成分将按其密度梯度重新分布聚集，从而将单个核细胞与其他血细胞分离。 [材料] 淋巴细胞分层液（Ficoll-Hypaque，比重为1.077±0.002g/L）、 肝素溶液（200U/ml）、无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液，2%的台盼蓝染液。 离心管、毛细吸管、水平离心机、注射器等。 [方法] 无菌采集人静脉血2ml，用肝素溶液抗凝（每1ml 全血加20U肝素），加Hank’s液2ml作等倍稀释。 用毛细吸管将稀释的抗凝血沿管壁轻缓地加入盛有2~3ml淋巴细胞分层液的离心管中，使血液重叠于分层液上，两者间保持界面清晰。 将加好血液的离心管置水平离心机，2000rpm离心20min后，小心取出。离心后的血液成分分布如图 。 图 密度梯度离心法分离前后血细胞分层示意图 将毛细吸管轻轻插入，吸出白色云雾状的单个核细胞层；或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板后，再用另一支毛细吸管仔细吸出单个核细胞层，用5倍体积的Hank’s液洗涤3次，每次1500rpm，离心10min。 细胞计数：将洗涤后的细胞加0.5ml的完全RPMI-1640培养基（含10%灭活的小牛血清）制成细胞悬液。取0.1ml细胞悬液与2%冰醋酸等量混合，用血球计数板按白细胞计数法计数，并按下式计算出4个大方格内的细胞数： 细胞数（/ml）= 4个大方格细胞数×104×稀释倍数 4 细胞活力检查：取2滴细胞悬液与1滴2%台盼蓝染液混匀，5min后在高倍镜下观察，活细胞不着色，死细胞染成蓝色，计算活细胞百分率。 [注意事项] 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。 将稀释血加入分层液上时，动作一定要轻缓，切不可冲散分层液而使血液与之混合，以免影响分离效果。 此法分离所得的细胞悬液中含有少数单核细胞，利用单核细胞对玻璃具有粘附力的特点，可用以下粘附去除法去除： 玻璃平皿吸附法：将单个核细胞悬液倒入玻璃平皿中，置37℃温育30min，单核细胞便粘附在平皿上。吸出未粘附细胞，即可获得大于95%的淋巴细胞。 玻璃纤维柱法：将单个核细胞悬液倒入装有玻璃纤维的柱层中，置37℃温育45min，用预温的37℃的Hank’s液冲洗，收集洗脱细胞，即主要为淋巴细胞。 实验 、E玫瑰花结试验 （erythrocyte rosette test） 人体T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）受体，它是T细胞的特异性标志。在体外一定条件下，将T细胞与SRBC混合，SRBC能结合于T细胞周围，形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的玫瑰花样的花结，称为E玫瑰花结。本试验可用于计数T细胞，了解机体的细胞免疫状态；也可将SRBC用溴化二氨基异硫氢化物（AET）处理后与T细胞形成大花结，再经淋巴细胞分层液离心花结形成细胞，并经低渗溶液溶解其中的SRBC而分离T淋巴细胞。 E玫瑰花结试验分为总E（Et）花结试验和活性E（Ea）花结试验。前者检测的是标本中T淋巴细胞的总数，而后者检测的是对SRBC具有高度亲和力的那部分T淋巴细胞。Ea花结试验更能敏感反映机体的细胞免疫功能。 根据所需血量的多少，E玫瑰花结试验分为常量法和微量法。以下介绍常量法。 [材料] 淋巴细胞分层液（比重为1.077±0.002g/L）、Hank＇s（无Ca2+ 、Mg2+）、Alsever溶液。 SRBC悬液：自绵羊颈静脉无菌采血，放入盛有玻璃珠的无菌三角烧瓶，摇动数分钟，使之脱纤维。每10ml血加5mlAlsever溶液混合，置4℃冰箱备用。 吸收灭活的小牛血清：小牛血清置56℃水浴30min灭活。取2体积灭活的小牛血清，加1体积压积的SRBC，混匀后置37℃温育30min，离心沉淀SRBC，吸取上清液放4℃冰箱备用。 瑞氏染液、0.8%戊二醛。 离心机、毛细吸管、载玻片等。 [方法] 无菌采集人静脉血1ml，肝素溶液抗凝，用Hank’s液等倍稀释，经密度梯度离心分离淋巴细胞，用含20%小牛血清的Hank＇s液将细胞调整为