基因诊断、PCR等介绍.ppt

基因诊断、PCR、测序等介绍;PCR;精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”;PCR技术;*;PCR原理;PCR原理;PCR原理;PCR原理——TaqManTM技术;PCR 扩增模式图;*;荧光PCR技术原理;内标控制系统（Hex、Cy5）;内标控制系统 (internal control);内标质控的作用;定量标准品;*;扩增曲线;荧光阈值;Ct值;Ct值的重现性;Ct值的代表意义;定量反应性的确认;采用UDG 酶 和 dUTP 37摄氏度，UDG酶能水解掺有dUTP的DNA模板，达到消除污染的目的。 组分的高度集成，按比例混合，易于操作 ;常见PCR仪器;常见PCR仪器;常见PCR仪器;细胞膜;　　广义的分子诊断包括临床生化、免疫和核酸检测，但目前主要指用各种生物学技术检测样本当中的遗传物质（DNA RNA），诊断疾病、判断预后，监测和指导治疗效果。;PCR检测方式的演变;应用领域的拓展;分子诊断技术的特点演变;诊断的对象;分子诊断未来趋势;总结;总结;测序(Sequencing); 在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。;核酸序列分析的目的意义和策略;测序的常用方法;Sanger双脱氧链末端终止法; 在DNA合成时，利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的5′末端，而3′不同的DNA片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，直接读出DNA的核苷酸序列。;*;*;P100;实验所需原料;（一）模板 纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以用作Sanger法测定的模板。模板的质量和所用的DNA聚合酶的种类是至关重要的。 通常采用M13噬菌体颗粒分离到的单链DNA模板效果最佳??用变性双链DNA作模板则难获此效果。小量制备质粒DNA常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑制剂所污染，前两者可被用作随机引物，造成假象和强终止现象，使测序胶含糊不清。采用小量制备质粒DNA测定未知DNA克隆片段的序列，并不可取，如果用CsCl-溴化乙锭梯度离心结果纯化质粒DNA，测序结果会好得多，但又耗费大量的人力和物力。;（二）引物 酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。 在许多情况下可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。也可用Sanger法测定变性双链DNA模板序列（如变性质粒DNA）。以上两种情况都可以采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与未知DNA序列互补的引物。M13噬菌体重组子的通用测序引物一般长15-29bp，与紧靠M13mp18多克隆位点区的HindIII或M13mp19多克隆位点区EcoRI位点的序列互补。这些引物同样也可用于PUC质粒的DNA进行“双链”测序，并且已经商品化。;（三）DNA聚合酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段 Klenow大片段----DDDPI是由分子量109KD一条多肽链组成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成2个片段，1个片段分子量为76KD，有聚合酶，3’→5’外切酶活力，此片段称为Klenow片段，另一片段34KD，有5’→外切酶活力。 此酶是末端终止法最早采用的酶，用它进行测序常常产生较高的本底和假带，催化链延伸反应的能力也较差，通常只能读出距引物250个核苷酸以内的序列。此酶价格便宜，容易获得，对于已知序列DNA次级克隆的鉴定仍有应用价值。 2、测序酶（Sequenase） 测序酶是经过改造的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3’→5’外切酶活性。活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA序列的首选酶。该酶及名称是HSB公司的专利。试剂盒已商品化。 3、TaqDNA聚合酶 Taq酶用于序列测定，除具有很好的链延伸性能外，还可以在高温（70-80℃）进行反应的优点，因而能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测定的影响，将PCR与末端终止法