磁珠提取方法.pptVIP

2021/9/12 * HIV RNA提取 HIV阳性样本梯度稀释成1/5,1/25,1/50,1/100和1/200 五个浓度,提取RNA,原样本提取后用TE按相同比例稀释 ,上机比较。 稀释组 磁珠提取 1 - 28.88 1/5 32.09 31.29 1/5 35.78 33.93 1/50 37.17 35.59 1/100 38.83 36.12 1/200 - 37.33 2021/9/12 * HIV 样本稀释梯度: 1/5,1/25,1/50,1/100和1/200 2021/9/12 * HIV核酸国家参考品检测 HIV RNA灵敏度和定量参考品:B2－B5（至少检出B2-B3） 2021/9/12 * HIV RNA线性参考品:A2－A5。 2021/9/12 * HIV RNA荧光定量标准曲线, 线形相关系数:0.9907 2021/9/12 * HIV 阳性参考品:P1, P2, P3, P5, P7, P8 2021/9/12 * HIV阳性参考品 Ct HIV阳性参考品 Ct P1 32.94 P5 26.42 P2 35.98 P7 28.93 P3 37.61 P8 32.55 HIV阳性参考品检测 2021/9/12 * 中检所HBV核酸定量标准品检测 灵敏度参考品 L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 理论浓度对数值 8.342 7.619 6.649 5.672 4.715 3.636 2.043 Ct 15.04 16.97 20.40 22.04 26.34 29.03 35.17 2021/9/12 * HBV核酸定量标准品:L0～L6（L0～L5必须检出,L6仅供参考） 2021/9/12 * HBV核酸定量标准品荧光定量标准曲线 2021/9/12 * 磁珠式核酸提取体系 2021/9/12 * 核酸提取的总体要求 高质量:纯度高并且尽可能不破坏核酸 高产量:样本量一定时尽可能提取多的核酸 高通量:同时提取多个标本 自动化:降低劳动量;生物科技的飞速发展,需要处理的核酸样本迅速增多,自动化提取核酸成为一种迫切需要的选择。 2021/9/12 * 磁粒法核酸提取的特点 步骤: 裂解→核酸结合→洗涤→洗脱 特点: 提取时间短 不使用酚、氯仿 用磁分离替代离心分离易于自动化,可以实现高通量提取 目前处于市场发育阶段,是未来发展的方向 主要产品为国外产品:Promega、Roche、KingFisher、Dynal等,大多需要与专用仪器配套 2021/9/12 * 提取方式 时间 自动化 酚、氯仿 经典方法 长 难 有 玻璃粉法 短 难 没有 离心柱法 短 难 没有 磁粒法 短 容易 没有 各种提取方式操作比较 2021/9/12 * 磁粒法核酸提取基本步骤 裂解细胞或病毒颗粒 核酸与磁粒结合 磁分离弃上清 洗涤缓冲液洗涤磁粒 磁分离弃上清 洗脱液将核酸从磁粒洗脱 磁分离弃磁粒,收集上清 2021/9/12 * 结 合 洗涤 洗脱 磁粒法提取核酸示意图 2021/9/12 * 磁粒提取试剂操作方式 磁架 磁笔 自动提取仪 2021/9/12 * 裂解 结合 磁分离 吸去废液 洗涤 洗脱 磁架提取核酸示意图 2021/9/12 * 裂解 结合 转移磁粒 洗涤 洗脱 转移磁粒 磁笔提取核酸示意图 2021/9/12 * 自动仪器提取 自动提取的原理与磁笔提取相同,只是用机器的运转代替手工操作,实现高通量提取和减少工作量。 2021/9/12 * 磁珠提取方法的优化 裂解:裂解液配方,作用时间和温度等 结合:结合液的选择和用量等 洗涤:洗涤液配方等 洗脱:洗脱时间和温度等 2021/9/12 * 主要实验结果 与其他方法或类似商业化试剂盒的比较 核酸提取的灵敏度: HCV RNA,HIV RNA,HBV DNA 2021/9/12 * 与Qiagen 磁珠式核酸提取试剂盒的比较 HCV RNA提取比较 Ct值 方法 HCV样本1 HCV样本2 HCV样本3 Promega体系平行1 27.60 30.21 27.39 Promega体系平行2 27.72 30.84 27.20 Qiagen kit平行1 27.86 39.00 28.82 Qiagen kit平行2 27.33 33.58 28.55 2021/9/12 * HBV DNA提取比较 方法 HBV样本1 HBV样本2 Promega体系平行1 26.65 32.78 Promega体系平行2 26.84 32.52 Qiagen kit平行1 26.70 32.96 Qiagen kit平行2 26.71 32.28