第十三章分子生物学技术.pptxVIP

第十三章分子生物学技术;分子生物学技术;; 第一节 重组DNA技术-基因工程 ; 一、限制酶 ;1、限制酶的命名 ;2、限制酶识别序列和切割形成 ;;部分常用限制酶及切点;互补末端连接;产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：;3、特点： ;二、基因运载体及其选择 ;载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。 ;（一）.质粒plasmid ;常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。 ;?（二）.λ-噬菌体(λphage);1、置换λ载体 – 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。 2、插入λ载体 – 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。 ;裂解途径;（三）.粘粒(cosmid vector)（30～40kb） ;(四) 大片段DNA克隆载体 ;1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） ;2、噬菌体PI载体和PAC ;3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）;YAC 的主要功能成份有三： ;三、DNA重组与分子克隆化 ; 基本原理与过程： ;分离纯化目的基因目的基因 + vector =重组DNA分子;;重组DNA和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源） ;从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 ;筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone） ;筛查含有目的基因的细胞克隆;四、目的基因表达 ;目的基因表达 ;（一）．真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达 ;(二)、真核细胞基因在真核细胞中表达 ; 五 、基因文库 基因文库（gene library）,应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。;（一） 构建基因组DNA文库;（二）染色体特异的基因文库  （ chromosome specific library） ; （三）cDNA文库（cDNA library）