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半夏曲炮制过程中优势微生物的鉴定 研究半夏曲不同发酵时间点的微生物种类、数量变化以及优势菌种的分离 鉴定，为探讨半夏曲炮制机制奠定基础。用选择性培养基对半夏曲发酵过程中5 个时间点（0 ，18，36，54，72 h ）样品中的细菌、霉菌、酵母菌分别进行培养、 菌落计数、分离纯化优势菌种；采用16S rDNA ，26S rDNA 序列分别对优势细 菌、优势真菌进行鉴定。结果表明，半夏曲发酵过程中细菌数量少、变化平缓， 而酵母菌和霉菌数量发酵至54 h 时迅速增加，至发酵结束时达1×107 CFU·mL-1 以上；通过NCBI 同源性比对及构建系统发育树，鉴定出半夏曲炮制过程中的优 势细菌为Streptomyces sp.，Bacillus pumilus ，B. subtilis ，B. aryabhattai ，Bacillus sp.；优势酵母菌为Meyerozyma guilliermondii ；优势霉菌为Paecilomyces variotii ， Byssochlamys spectabilis，Aspergillus niger 。提示半夏曲的发酵过程涉及多种微 生物共同参与，其中以酵母菌和霉菌为主。M. guilliermondii ，P. variotii，P. variotii， A. niger 和Bacillus sp.等优势菌种可能在半夏曲炮制中起重要作用。 标签： 半夏曲； 发酵； 优势菌种； 16S rDNA 和26S rDNA ； 系统发育 树； 菌种鉴定 半夏曲是临床上常用的中药炮制品之一，为清半夏、六神曲、生姜汁、面粉、 白矾发酵而成。半夏曲含有酵素等， 具有祛湿化痰、降逆止呕、健脾温胃的功 能， 用于治疗心下痞满， 不欲饮食， 倦怠乏力， 大便不调[1 。半夏曲的现 代研究侧重处方筛选、化学成分等，对于半夏曲炮制中起重要作用的微生物研究 甚少。目前，仅蔡清宇等[2 初步表明生半夏曲中含较多杂菌，在血平板培养基 中培养出革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性杆菌及球菌，在沙氏培养基中未培养出真 菌。本实验对半夏曲发酵炮制过程中不同时间点的微生物菌群种类和数量变化进 行初步研究，并分离鉴定优势菌种，研究结果将为揭示半夏曲炮制机制奠定基础。 1 材料 1.1 仪器 MILLIQ 超纯水仪（美国Millipore 公司）；培养箱（上海一恒科技有限公司）； PTC200 PCR 仪、电泳仪、凝胶成像分析仪（美国伯乐公司）；I16K 高速低温离 心机 （Sigma 公司）。 1.2 试剂 硫酸链霉素、琼脂粉、溶菌酶购自北京索莱宝；脑心浸液肉汤培养基、马铃 薯葡糖糖琼脂购自青岛海博，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（自配）；植物基因组 DNA 提取试剂盒、细菌基因组DNA 提取试剂盒、酵母菌基因组DNA 提取试剂 盒、2×Taq PCR master Mix 购自北京天根；溶菌酶缓冲液、PCR 引物购自上海生 工；琼脂糖购自Innvitrogen 公司；DM2000 Marker 购自康为世纪公司。