细胞迁移侵袭实验操作步骤.pdfVIP

实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中， 小室内称上室， 培养板内称下室， 上 下层培养液以 聚碳酸酯膜 相隔， 将研究的细胞种在上室内， 由于聚碳酸酯膜有通透性， 下层 培养液中的成分可以影响到上室内的细胞， 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜， 就 可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1 材料准备： 可拍照显微镜， Transwell 小室，孔径 8 μm，没包被胶的 (Coster 和 Corning 公司的也较常 用) ，Transwell 迁移实验的细胞培养板 24 孔板。细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室 相配套， BD公司的 Matrigel ，无血清 DMEM，(1%胎牛血清 )DMEM和 1640 培养基， DMEM完全 培养基， 1640 完全培养基（也可加到 20%血清），无菌 PBS，棉签，胰酶， 4%多聚甲醛固定 液或者甲醇，结晶紫染液（ % （g/ml ）PBS结晶紫） 2 步骤和流程 基质胶铺板： 用 BD公司的 Matrigel 1 ：8 （根据细胞产生 mmp的量来决定）稀释，包被 Transwell 小室 底部膜的上室面，置 37℃30min 使 Matrigel 聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不 是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液， （用PBS洗 1－2 遍），用含 BSA的无血清培养基 重悬。调整细胞密度至 5 ×105/ml 。 接种细胞 ①取细胞悬液 100 μl加入 Transwell 小室。 ②24 孔板下室一般加入 600 μl含 20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常 会有气泡产生， 一旦产生气泡， 下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了， 在种板的时候要 特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养 12－48h （主要依癌细胞侵袭能力而定） 。24h 较常见， 时间点的选择 除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法， “贴壁”细胞计数， 这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后， 可以附着在膜的 下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出 Transwell 小室，弃去孔中培养液，用无钙的 PBS洗 2 遍，甲醇固定 30 分钟，将小室 适当风干。 %结晶紫染色 20 min ，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用 PBS洗 3 遍。 400 倍 显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料 （1）Transwell chamber: 24-well, μm pore membranes (Corning) （2）细胞培养相关试剂：无血清培养基， 10％血清培养基， PBS，％ EDTA （3）固定液：甲醇 （4）染色液： Giemsa染液 （5）封片剂：中性树胶 （6）其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片 操作步骤 （1）所有细胞培养试剂和 Transwell chamber 放在 37℃温育； （2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用 PBS和无血清培养基先后洗涤 5 一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为