实验一质粒的提取.ppt

实验一质粒的提取 第一页 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 第二页 实验目的 了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法； 掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。 第三页 实验原理 质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 第四页 结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等 第五页 第六页 pET-32a Vector The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli. 第七页 pET-32 cloning/expression region 第八页 Vector (pET-32a) Gene fragment (SmPR10) pET-32a-SmPR10 第九页 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时, 在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。 4000kb 1kb到200kb 第十页 实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器 第十一页 第十二页 第十三页 第十四页 第十五页 （二） 材料 大肠杆菌E. coli DH 5α含重组质粒 pET-32a-SmPR10 第十六页 （三） 试剂 1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。 第十七页 2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， pH8.0）； EDTA （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸 ； 28.5ml H2O 溶液I：低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。 EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 Tris?Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。 溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH(pH12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。 溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。但是质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。 第十八页 5. 氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。 6. RNaseA 将RNA 酶 A溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10