固相膜免疫分析技术.ppt

原 理 Dot-ELISA的实验原理与常规的ELISA相同，不同之处在于Dot-ELISA所用载体为NC膜。其原理为样品中的抗体或抗原与预先包被在NC膜上的抗原或抗体发生抗原抗体反应，然后再加入相应的酶标二抗进行反应，反应结束后，通过酶催化底物，形成有色的沉淀物，产生显色反应，根据染色条带或斑点的有无或深浅，对抗体或抗原进行检测。阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色条带或斑点。 图11-4 Dot-ELISA示意图 第二十八页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 技术要点 抗原包被：优化抗原的浓度。 抗原抗体反应：滴加样品血清，待检抗体与NC膜上抗原结合。 确定酶结合物最佳稀释度：一般以阴性样品不显色而阳性样品显色最强的酶结合物稀释度为最佳稀释度。 显色反应：在盐酸联苯胺和过氧化氢为底物时，溶液pH值应在5.8～6.0，此时反应最灵敏。 第二十九页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 方法学评价 优点： 1.吸附蛋白能力强 2.可同时检测多种抗体 3.其它：实验和结果判断不需特殊设备条件，结果可长期保存 第三十页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 固相膜免疫分析技术 固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术 第一页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 目 录 第一节 概 述 第二节 免疫层析试验 第三节 免疫渗滤试验 第四节 斑点酶免疫吸附试验 第五节 免疫印迹试验 第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素 第七节 固相膜免疫分析技术的临床应用 第二页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 第一节 概 述 第三页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 重点提示 固相膜免疫分析技术 常用的固相膜和标志物 固相膜的技术要求 第四页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 固相膜免疫分析技术 是以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜渗滤作用或毛细管虹吸作用使样本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物或酶标记物与之反应形成肉眼可见的显色结果。 第五页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 常用的固相膜 玻璃纤维素(fiberglass) 膜尼龙（nylon） 膜硝酸纤维素（nitrocell-ulose，NC)膜 NC膜或尼龙膜是常用的固相膜 第六页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 常用的标志物 酶和有色微粒子 彩色胶乳 荧光素 胶体金和胶体硒等 其中以胶体金和荧光素最为常用 第七页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 固相膜的技术要求 孔径：穿流法的膜一般选择0.4μm左右；横流法的膜可选择5μm?10μm。 流速：孔径和分布结构影响膜的流动速率，孔径大，流速快。 蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示。 均一性：优质的膜具有良好的均一性。 第八页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 第二节 免疫层析试验 第九页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 重点提示 原理 常用的免疫层析试验 胶体金免疫层析试验的测定模式 荧光免疫层析试验 技术要点 第十页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 原 理 免疫层析试验是以硝酸纤维素膜为固相载体，样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过检测标记物胶体金颗粒或荧光素等，在短时间内（20min)聚集而得到直观的试验结果（显色）。 第十一页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 常用的免疫层析试验 根据标记物的不同，免疫层析试验可以分为： 胶体金免疫层析试验：标记物为胶体金，多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。 荧光免疫层析试验：标记物为荧光素，标记相应的抗体或抗原，然后利用荧光检测仪检测试剂条上富集的反应结合物激发产生的荧光强度，从而对标记物浓度进行检测的一种方法。 第十二页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 胶体金免疫层析试验的测定模式 双抗体夹心法检测大分子抗原 竞争法检测小分子抗原 间接法 第十三页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 双抗体夹心法检测大分子抗原 G处为金标特异性抗体，T处为包被特异性抗体，C处为包被抗免疫球蛋白抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。 图11-1 免疫层析试验双抗体夹心法原理示意图 第十四页，编辑于星期三：二十一点 三十二分。 竞争法检测小分子抗原 图1