蛋白质纯化技术.pptVIP

蛋白质纯化的前期准备 关于蛋白质我们已知什么？ 最好的来源？ 蛋白质纯度要求？活性要求？ 纯化蛋白的量？ 如何进行鉴定？ 纯化时间长短？ 最终花费？ 纯化方案？ 第二十九页，共82页。 1、选择实验材料及预处理 选择实验材料 物种的选择 组织的选择 实验材料预处理 液体材料 过滤 离心 固体材料 洗涤：自来水—蒸馏水—提取缓冲液 材料破碎： 第三十页，共82页。 材料破碎 机械剪碎 研磨 反复冻融法 超声破碎法 高压匀浆法 酶解法 第三十一页，共82页。 2、蛋白质的提取 ①提取分离原则 尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失（温度过高、 pH、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素） 选择合适的pH、选择合适的离子强度 第三十二页，共82页。 2、蛋白质的提取 ②提取液成分的确定 pH 缓冲液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 柠檬酸-柠檬酸钠… 离子：动物 NaCl, 植物KCl 还原剂:DTT… 蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSF… 金属离子螯合剂: EDTA, EGTA… 去污剂:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20 甘油 ③温度 0~4℃ 第三十三页，共82页。 3、蛋白质的粗分级（粗提） 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂