核酸非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.docVIP

PAGE / NUMPAGES 试剂等 电泳仪、电泳槽、电泳玻璃板〔数套〕、鲨鱼齿〔67空，数条〕、边条〔数对〕、加样枪〔1ml、5ml、10μl、100μl、200μl〕、脱色摇床、适宜大小的托盘数个 95%乙醇、冰醋酸、纱布、医用胶布、剥离硅烷和亲和硅烷〔鼎国〕、10% APS〔过硫酸铵〕〔液体状试剂一周内有效〕、TEMED、40%丙烯酰胺〔19:1，上海生工〕、尿素〔进口，amresco〕，未注明的均为国产分析纯试剂 试剂配制 亲和硅烷：加10μl Bind-Silane〔亲和硅烷〕于1ml含10μl醋酸的95%乙醇中，混匀后备用。〔涂玻璃板用〕 固定/脱色液：10%乙醇，蒸馏水配置〔可重复用〕 硝化液：15ml硝酸/L蒸馏水 染色液：1g AgNO3/L蒸馏水 显色液：30 g Na2CO3/L蒸馏水〔温度不行高，否那么显色背景深；可预冷，预冷后可延长显色时间，有助于减轻显色背景，一般状况时室温即可，显色约需3～5min〕 终止显色液：10%冰醋酸 电泳用的TAE用蒸馏水配制，制胶用的全部试剂均用双蒸水配制。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 制胶及电泳 〔1〕胶板的预备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤洁净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%乙醇擦拭。 1 用1～2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭洁净、均匀；〔以平整、光滑的一面为正面〕〔第一次用的玻璃板最好擦2～3次〕 2 用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；〔第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2～3次〕 3 用加样枪取0.5～1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；〔擦至感觉特殊光滑为止〕 4 用1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；〔可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余局部〕 5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，假设有，可吹走；取0.4mm的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，预备灌胶。 〔2〕制胶：称取尿素21g，参加17ml双蒸水加热约二三十秒溶解，待冷却后参加10ml 5×TBE，冰浴至冰手时参加7.5ml 40%丙烯酰胺〔19:1〕，然后参加225μl 10%过硫酸铵和50μl TEMED，快速混匀，预备灌胶。 〔3〕灌胶：用5ml加样枪将制备好的胶液沿玻璃板中部缓慢参加到胶板玻璃板之间的空隙，留意不能在胶中形成气泡〔要屡次试验以把握技巧、把握加样速度、调整玻璃板倾斜度、手按、竖起玻璃板、便小扣变加样等〕。胶灌满后，将鲨鱼齿的平端插入胶液下5mm左右〔不行过深，以免后面不能加样；也不行过浅，以免上样量过小〕，同时防止梳齿平端下方消灭气泡，于室温下静置2h，使胶完全聚合后使用。 〔4〕预电泳：撕去胶布，两端平行用力拔出梳齿，将玻璃板和梳齿上的多余凝胶擦洗洁净，用蒸馏水漂洗玻璃板、梳子。将玻璃板装到电泳槽上，在下方电泳槽中参加1×TBE至没过玻璃板下端约1cm，装好电泳槽，参加1×TBE至没过玻璃板上端约1.5cm处，用梳齿刮去玻璃板间隙间的碎胶，再用5ml加样枪将其吹洁净，反转梳齿，将鲨鱼齿插入凝胶胶面下约0.5mm，并用夹子夹紧，梳齿间空隙即为加样孔。120w恒功率，预电泳30min。 〔5〕点样：点样前用加样枪吹吸每个上样槽，将梳齿间隙间油状液体吸洁净，以利于样品更好的沉降。把DNA样品与上样缓冲液混合，每个加样孔加5~7μl的扩增产物。 〔6〕电泳：140-160w恒功率电泳，待溴酚蓝至胶的四分之三处时〔大约需要1.5~2h〕，终止电泳，回收电泳液〔可重复用一段时间，当觉察电压下降很多时要更换电泳液，或者补加蒸馏水可连续用一段时间〕，取下胶板，将两块玻璃板轻轻分开，凝胶留在长玻璃板上。 银染 〔1〕固定〔脱色〕：在托盘1中参加1L固定/脱色液，将有胶的玻璃板胶面对上放入托盘中，置于脱色摇床上低速摇6～10min。 〔2〕洗胶：在托盘2中用1L蒸馏水漂洗凝胶约10s。 〔3〕硝化：在托盘3中用1L硝化液硝化凝胶5min。 〔4〕洗胶：连续在托盘2中漂洗凝胶10s。 〔5〕染色：在托盘4内参加1L染色液，将胶板放入托盘中低速摇15min。 〔6〕显影：从染色液中取出胶板，马上将胶板置于显色液中低速摇至显色，直至胶上全部的条带都消灭。 〔7〕定影〔终止显色〕：从显影液中取出胶板放入终止液中约1min以终止显色。 〔8〕洗胶：将胶板置于自来水下冲洗正反面直至洁净。 〔9〕干胶：室温下自然