第11章临床免疫检验仪器.pptxVIP

第十一章 临床免疫检验仪器;学习要求;主 要 内 容 ;;一、酶免疫技术的分类;由美国SYVA公司最先研制成功，主要用于小分子抗原或半抗原的测定，在药物测定中应用最多。 原理：半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的生物活性，当酶标半抗原与抗体结合后，半抗原分子上的酶蛋白与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响，酶的活性受到抑制。测定时标本中的半抗原、酶标半抗原与抗体竞争性结合，标本中的半抗原含量越高，加底物后其OD值越高。;利用重组DNA技术制备β-半糖苷酶的???个片段：大片段称为酶受体（enzymeacceptor，EA），小片段称为酶供体（enzymedonor，ED）。两个片段本身均不具酶活性，但在合适的条件下结合在一起就具有酶活性。利用这两相片段的特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定（CEDIA, clonedenzymedonorimmunoassay）。 ; CEDIA的反应模式为竞争法，测定原理为：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与EA结合。;EMIT与CEDIA原理图;二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构; （一）酶免疫分析仪的类型-1; （一）酶免疫分析仪的类型-2;;酶标仪的工作原理图;?测定波长：滤色片;?测定波长：带通滤色片;低通滤光片;405nm ：碱性磷酸酶 （PNPP偶氮法 ） 450nm：辣根过氧化物酶（HRP）， 2,2,-二 氨基偶氮苯（DAB），pH 5.0 492nm：辣根过氧化物酶（HRP），硫酸作为 终止剂,黄色的联苯醌 540nm ：磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，主要用来检测细胞增殖情况 ，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合 ；双缩脲 ;570nm ：MTT ，细胞的存活率 （DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值，而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，而且建议以655nm作为参考波长。 630nm ：作为参考波长。 ;MTT全称为3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝 ;?测定波长：酶标仪常用滤色片;“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630 nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。双波长测定结果的CV值远小于单波长测定结果 ;酶标仪在用单波长测定吸光度时，除受到测定干扰（样本的浊度、干扰色等）和电路干扰（包括噪音、漂移、电压等）等因素外，受液体表面张力的影响也很大。在检测过程中，由于液体表面张力的作用，液体的表面不是一个平面，而是形成一个凹面，从侧面看似凹透镜，这样不可避免会影响光路的正常通过。由于凹液面的影响，光线在通过液体时，除正常被液体吸收一部分外，尚有部分被折射和反射（如光线通过凹透镜那样），影响吸光度的检测。而酶标仪使用的又是通过光导纤维传播的点光源，如果每次能在同一部位检测，吸光度的重复性将得到保证，但由于机械运动等造成的误差，不可能保证每孔都在相同部位被检测，因此造成了孔与孔之间有一定的差异。;测定的吸光度范围?;光学系统;检测速度;震板功能?;温育功能;软件功能??;语言界面;比色光度计部分： 读板类型：6孔—384孔板 波长选择：2个单色器 波长范围：200-1000nm 带宽：5nm 波长分辨率：1nm 光源：氙灯（Xenon flash lamp） 探测器：光电二级管（PDT） 线性范围：0-4Abs, (96孔板) at 450nm,? ±2% 0-3Abs, (384孔板) at 450nm,? ±2% 吸收值分辨率：0.001Abs 准确性： ±1%, at 400—1000nm (0-3Abs) ±2%, at 200—399nm (0-2Abs) 精确性：SD0.001Abs 或 CV0.5%, at 450nm (0-3Abs); 读板类型：6孔—1536孔板 波长选择：4个单色器 激发光波长：200-800nm 发射光波长：270-840nm 激发光带宽：5nm