重组人促红细胞生成素的分离纯化工艺.pptVIP

26.5.1重组人干扰素生产技术及工艺 26.5.1.1 重组人干扰素概述 干扰素（interferon，IFN）是机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。 根据干扰素来源及其基因序列和氨基酸组成不同，可将干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素的表达细胞来源类似，包括干扰素-α、β、ω、τ和λ。用病毒等刺激外周血浆样树突细胞（pDCs）可以产生干扰素-α、β、ω的13种亚型，3种干扰素-τ亚型和干扰素-λ，但是没有Ⅱ型干扰素-γ。 第二十六页，共45页。 干扰素的生物学活性相当广泛，主要包括广谱抗病毒活性、直接抗肿瘤活性和免疫调节活性。 1.干扰素抗病毒作用的特点是：①不能杀死病毒，只能抑制；②对病毒没有直接的作用，通过细胞核内的基因产生蛋白质因子发挥作用，因此不同细胞对干扰素的敏感不同；③病毒大量复制时引发细胞炎症应答，此时易产生作用；④当病毒DNA已整合到宿主细胞的染色质中时，干扰素不能发挥其抗病毒活性。 2.干扰素抗肿瘤作用：①直接抑制肿瘤细胞；②调节宿主抗肿瘤免疫反应；③改变宿主与肿瘤细胞的关系。 第二十七页，共45页。 3．干扰素的免疫调节活性①对免疫监视系统②对免疫防卫系统③对免疫自稳系统的调节 干扰素的临床应用广泛。干扰素在机体的免疫系统中起着非常重要的作用，在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节等多种生理活性。 （1）抗病毒 干扰素-α/β能诱导机体对多种肝炎病毒、鼻病毒、人乳头瘤病毒、艾滋病病毒和多种RNA病毒产生抵抗力。（2）治疗肿瘤 干扰素是一种较理想的肿瘤抑制蛋白，它能调节正常的和恶性化的细胞生长和分化。 （3）其它应用 有报道用干扰素治疗精子缺乏症、多发性硬化症、黄斑变性症等。 第二十八页，共45页。 26.5.1.2 重组人干扰素生产技术和工艺 重组人干扰素的生产主要包括工程菌的构建、发酵、发酵产物的分离纯化及制剂加工等单元操作技术和工艺。 一、工程菌的构建 （1）干扰素基因的克隆 （2）干扰素表达载体的构建（3）基因工程菌应具备的特性：①革兰阴性，杆状，长度3～5μm。30℃培养24h，其菌落为2.5～3.0mm，灰绿色半透明状，具有粘稠性。②不能将明胶、淀粉液化为可溶性单糖，不能利用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸作为碳源。③遗传特性 DNA 中G+C含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸四环素和氨苄青霉素的抗性。④放射性免疫学效价不能低于2.0×109IU/L。 （4）菌种库的建立及保存（5）工作菌种库的建立及保存 第二十九页，共45页。 二、重组人干扰素-α2b的发酵工艺及过程控制 生产菌种 接种 菌种活化 种子罐培养 发酵罐培养 发酵液降温 菌体搜集 离心 菌体冷冻保存 蒸汽灭菌 蒸汽灭菌 配制培养基 原料 蒸汽灭菌 1.发酵工艺过程 第三十页，共45页。 2.发酵过程控制 (1)假单胞杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态。 (2)一般的，种子培养基的营养成分宜丰富些，尤其是氮源的含量应较高（即C/N低）。 (3)发酵要求培养液中有足够的溶解氧，为了提高发酵罐的供养能力，往往需要增大搅拌转速，增加空气流量，或通入纯氧。 (4)假单胞杆菌你的生长最适温度与产物形成的最适温度是不同的。稳定而适中的温度既能保证菌体细胞膜的完整和细胞中酶的催化活性，又有利于提高干扰素的产量。 (5)pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。 (6)随着菌体繁殖，使整个发酵过程形成过多和稳定持久的泡沫。可采用机械搅拌和加入少量表面活性剂来消除泡沫。 第三十一页，共45页。 1.重组人干扰素-α2b的分离工艺过程： a.菌体裂解 b.沉淀 c.离心 d.盐析 e.离心与储存 2.重组人干扰素-α2b纯化工艺过程： a.配制纯化缓冲液 b.溶解粗干扰素 c.沉淀除杂质 d.离心 e.疏水色谱 f.沉淀 g.超滤 h.透析 i.阴离子交换色谱 j.浓缩和透析 k.阴离子交换色谱 l.浓缩 m.凝胶过滤色谱 n.无菌过滤分装 o.质量控制 3.重组人干扰素-α2b分离工艺控制： a.使用保护剂 b.使用絮凝剂 c.使用凝聚剂 4.重组人干扰素-α2b的纯化工艺控制： a.等电点沉淀 b.膜分离 c.疏水色谱 d.离子交换色谱 e.凝胶过滤色