解淀粉芽孢杆菌PEBA20生物膜表型特征及其与抑菌活性的关系汇总.docxVIP

山东农业大学 硕士学位论文 解淀粉芽抱杆菌PEBA20物膜表型特征及其与抑菌活性的关系 姓名：范素素 申请学位级别：硕士 专业：森林保护 指导教师：刘振宇 2011-06-02 山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 PAGE PAGE # 解淀粉芽抱杆菌PEBA20 解淀粉芽抱杆菌PEBA20生物膜表型特征及其与抑菌活性的关系 PAGE PAGE # 中文摘要 植物病害生防细菌的研究是生物防治领域的研究热点，但是生防菌的应用却受到防 治效果不稳定、抑菌活性易下降甚至丧失的限制，这在很大程度上与人工培养条件改变 了其自然属性有关。同时也有越来越多的证据表明，在自然生境下，大多数微生物是以 生物膜(biofilm)形式而不是浮游形式存在，微生物生活史中的大部分是在生物膜的状 态下完成的。 基于上述两点，本实验对一株杨树内生生防菌 Bacillus amyloliquefaciens PEBA20进 行了生物膜表型特征的测定，并研究了与生防细菌抗菌活性的相关性。 首先对PEBA20的野生型菌株 PEBA20-W0314的生物膜表型进行了系统阐述。 PEBA20-W0314在NA固体平板上培养5d时，其生物膜表型为 鸟巢状”，向四周扩展 范围较小，向上隆起明显，为近圆形；PEBA20-W0314在NB液体培养基中静置培养48h 时，其生物膜表型为致密，坚固，完整，表面有波浪状纹理。 对实验室规则人工继代过程中生物膜表型与抑菌活性的变化进行同步检测的结果 显示：整个过程约以第9代为分界，在第9代之前其生物膜表型及抑菌活性的变化较缓 慢，而在第9代之后生物膜表型和抑菌活性均开始发生显著变化。截止至第 9代， PEBA20对玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、杨树溃疡病菌 (Botryosphaeria dothidea)和禾谷丝核菌(Rizoctonia cerealis)的抑菌率仅依次下降了 9.1%、13.2%、5.4%和2.4% 。而其生物膜表型的变化也是从第 9代开始发生显著变化： 前期单菌落类型呈多样化，共先后出现 8类菌落类型，而后期单菌落类型逐渐减少，最 后只保留2种具有截然不同特性的单菌落；同时在气-液界面形成生物膜的厚度与坚固 性也呈逐渐下降趋势。表明野生型生防菌株 W0314在实验室长期继代保存时会发生生 物膜表型与抑菌活性的同步变化， 且两者变化规律存在相关性。对于PEBA20不同生物 膜状态下发酵液抑菌活性的检测，同时进行了皿内实验和杨树愈伤组织上对杨树溃疡病 菌的抑制实验。 比较了 W0314和NM0705的生物膜表型和抑菌活性，结果显示：与 W0314相比， NM0705的单菌落平坦，扩展面积较大，在气-液界面成膜较稀薄，坚固性差，生物膜半 定量法检测显示NM0705成膜菌的数量约为 W0314的1/2。同时NM705的抑菌活性相 对W0314其抑菌活性也显著下降，对四种指示病原真菌的菌丝生长抑制率分别下降了 89.3%, 56.9%, 38.5%, 92.3%。对 NM0705 进行 16SrRNA 和 tasA 基因的鉴定，测序结 果显示：NM0705的该两段序列与其野生株 W0314相比相似度为99%,为进一步利用 该菌株进行生物膜特性的研究奠定了基础，保证了菌株生物膜表型特征不同、但菌株种 类同一的准确性。 关键词：解淀粉芽抱杆菌；生物膜；表型；抑菌活性；相关性 Abstract Researches on bacteria with bio-control acticity has become a hot topic about the biological control, but it s application was confined due to the unstable of the antibacterial activity .This can be attributable to the difference environment between laboratory culture and natural conditions to a great degree. There are also Increasing evidence demonstrate that, in natural habitats, most microbes exist as biofilm rather than as plankton. Most time of the microbial life is under the condition of biofilm. Based on the above t