细胞生物学实验：实验八－植物愈伤组织的诱导分化.pptVIP

上次实验总结 实验名称：动物细胞原代培养 实验结果：全部实验小组都没有染菌，细胞生长旺盛，结果非常理想。 实验八 植物愈伤组织的诱导和分化 1 实验目的 了解培养基的配制过程； 掌握植物外植体的选择和表面消毒方法； 掌握无菌条件下愈伤组织的诱导操作方法； 了解植物组织脱分化过程中的形态变化特点。 2 实验原理 细胞的全能性: 低等生物＞高等生物；植物细胞＞动物细胞，幼嫩细胞＞年老细胞。 植物重要激素：生长素，细胞分裂素。 根据植物细胞的全能性，利用植物激素中的生长素和细胞分裂素等两类重要激素的不同配比，人为控制细胞的分裂和分化方向，实现对植物细胞和组织的脱分化、再分化和生根等。 烟草的组织培养优势 烟草≠香烟。 自1973年基因工程诞生以来，烟草成为典型的基因工程模式植物。由于其蛋白含量高，是理想的生物反应器受体植物。 本实验以烟草叶片为外植体，进行愈伤组织的诱导，掌握基本的植物组织培养实验操作技能。 3 实验材料,仪器和试剂 3.1 实验材料： 自然生长的烟草苗 3.2 实验仪器： 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、光照培养箱、酒精灯、镊子、脱脂棉、打火机、量筒、移液管、锥形瓶（灭菌）、培养皿（灭菌）、无菌滤纸、封口膜、橡皮筋、分析天平。 3.3 实验药品和试剂 70%酒精， 20% NaClO， 无菌水， 培养基配制用药品（见附件） 4 实验步骤 4.1 MS培养基的配制 烟草愈伤组织诱导培养基: MS + 6-BA 2 mg/L + NAA 2 mg/L + 蔗糖 30g/L + 琼脂 8 mg/L。 各种MS母液和激素母液均按附件中的配方配制。 高压蒸汽灭菌20分钟。 在超净工作台上分装培养基，每瓶约40 ml。 4.2 外植体的选择和灭菌 选取幼嫩的烟草叶片，撕成较小的碎片。 70%酒精中浸泡1-2min。 20% NaClO中灭菌7-10 min。 无菌水冲洗4-5次。 无菌滤纸上吸干水分，用手术刀将叶片切成1 -2 cm2左右的小块，接种于诱导培养基中。 经过3周的诱导培养后，即可挑取活力较好的愈伤组织用于继代培养。 4.4 愈伤组织的诱导 将接种有烟草叶片的诱导培养基放至光照培养箱中培养。 培养条件：26 ℃，12小时光照/12小时黑暗。 大约2-3天后可以见到烟草叶片增厚卷曲。 5-6天后可以见到叶片边缘膨大开始出现愈伤组织。 大约10天后愈伤组织比较明显。 3周后可以得到很好的胚性愈伤组织。 挑取活力较好的愈伤组织用于继代培养或其他后续操作，如原生质体的培养和转基因等。 5 实验数据的记录和分析 仔细观察植物细胞和组织脱分化的过程，并拍照保存图片。 统计叶片愈伤组织的诱导率。 诱导率=诱导了愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100% 6 思考题（简答） ⑴ 详细描述植物细胞和组织脱分化的过程，并附上图片。 ⑵ 简述植物组织培养的关键步骤。 祝大家取得好的实验结果！ * 原代培养4天的小鼠肝细胞（生长晕） 原代培养4天的小鼠肝组织块（10×） 指导教师：何春梅 林建中 表达载体 农杆菌EHA105 电激 共转染 诱导7d的愈伤组织 潮霉素筛选 分化 生根及basta筛选 炼苗 移栽大田 转化周期为30-40天，转化效率为70-80%，比传统转化方法缩短1-2个月。 组织培养是基因工程的基础 粳稻转化过程： 吸烟有害，种烟致富！ 烟草愈伤组织 魔芋愈伤组织 8 g 琼脂 定容至1 L，调pH为5.8，后在加入 10 ml NAA (0.2 mg/ml) 10 ml 6-BA（0.2 mg/ml） 1 g 水解酪蛋白 30 g 蔗糖 5 ml 铁盐（200×） 5 ml MS 有机（200×） 0.5 ml MS铜钴母液（2000×） 1 ml MS无机微量元素（1000×） 50 ml MS无机大量元素（20×） 用量（1000 ml） 试剂 表 MS培养基各成分的添加量 培养基的分装 外植体的选取与表面消毒 无菌水的冲洗 接种培养 *