细胞生物学：第三章－细胞生物学的研究方法.pptVIP

第三章 细胞生物学研究方法 （十）光学显微镜的制样技术 活体制样技术 徒手切片技术 使用刀片切取样品 冰冻切片技术 使用冷冻切片机 石蜡切片技术 使用石蜡切片机 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培养 （一）动物细胞培养 群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层； 克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。 群体培养（左）和克隆培养（右） 动物细胞培养示意图 原代培养 （primary culture）：即：培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养（passage），每代细胞分裂约3-6次。 细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。 细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 表三、实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 Henrietta Lacks BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP2／0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 （二）植物细胞培养 外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。 悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。 原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点： ①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； ②便于进行细胞融合，形成杂交细胞； ③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。 表达载体 农杆菌EHA105 电激 共转染 诱导7d的愈伤组织 筛选 分化 生根 炼苗 移栽大田 转化周期为30-40天，转化效率为70-86% 利用农杆菌介导方法转化水稻、筛选及再生过程 二、细胞融合 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 同核体：相同基因型的细胞融合而成。 异核体：不同基因型的细胞融合而成。 自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。 B淋巴细胞能分泌特异抗体，但不能长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌特异抗体。于是Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。 单克隆抗体技术 HAT: hypoxanthine，aminopterin，thymidine 三、显微操作技术micromanipulation technique 是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。 显微操作仪 转基因显微操作过程 1、难度系数3星以上： 人胃癌裸鼠原位种植转移模型建立 （3.7） 细胞凋亡实验 （3.6） 荧光原位杂交 （3.6） 体外细胞的原代培养、传代培养、冻存和复苏（3.6） Western Blot免疫印迹实验操作规程 （3.3） 免疫组化实验方法 （3.0） 质粒DNA提取与纯化 （3.0） PCR技术原理、实验步骤和应用 （3.0） RT-PCR实验方法简介 （3.0） 外源基因的诱导表达 （3.0） 丁香园（）精选实验： 2、难度系数4星以上： 转基因小鼠制备实验 （5.0） 凝胶迁移实验（EMSA） （4.7） 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）（4.3） DNA重组实验方